中期因子基因为靶的小干扰ＲＮＡ，其特征在于所述小干扰ＲＮＡ的核苷酸序列为：正义链：５’－ＧＧＡＵＵＧＣＧＧＣＧＵＧＧＧＵＵＵＣ－３’，反义链：５’－ＧＡＡＡＣＣＣＡＣＧＣＣＧＣＡＡＵＣＣ－３’。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及中期因子基因为靶的小干扰RNA (SiRNA)、含有该小干扰RNA 的载体，及其在制备抗肿瘤药物和防治新生血管异常增生的药物中的应用，属 于生物医药领域。
技术介绍
肝癌是种高侵袭性、高转移性的实体恶性肿瘤。尽管目前针对肝癌细胞 本身进行的手术切除、化疗和放疗等治疗方案日趋完善，但仍难以取得满意的 疗效，因此探索新的有效的治疗途径已成为提高肝癌生存率的关键。近年研究表明，与其他实体恶性肿瘤一样，肿瘤血管生成(angiogenesis) 是肝癌无限制侵袭生长和转移的基础，如果没有新生血管生成，原发肿瘤的生 长不会超过1 2mm3。肿瘤组织必须依赖从新生血管中获取营养和排泄代谢产 物。因此，以新生血管为靶点，抑制肝癌血管生成，切断肝癌和转移的"命脉"， 对肿瘤进行生物基因治疗己成为近几年新的研究热点；它与传统的以肿瘤细胞 为靶点的治疗手段相比，具有广谱、放大的抗肿瘤作用，且毒副作用小，不易 产生耐药性的特点。中期因子(Midkine， MK)是一个新发现的促血管生成因 子，其基因最初是在视黄酸(retinoicacid,RA)诱导分化早期的胚胎瘤细胞中被 发现的，定位于染色体llq11.2，由5个外显子和4个内含子组成，故又称视黄 酸反应性肝素结合性生长/分化因子。它是一种具有促细胞转化、促有丝分裂作 用、促血管生成、抗细胞凋亡和增强纤维蛋白溶解等肿瘤形成相关活性的碱性肝素结合性蛋白质，仅在胚胎中期和成年肾脏表达。已有的研究表明，MK能 促进内皮细胞分化，对人脑与脐静脉内皮细胞、PC12细胞、神经外胚层前体细 胞和NIH 3T3成纤维细胞具有有丝分裂原活性。在软琼脂培养中，MK能促进 SW13细胞克隆形成，而将经MK转染的SW13细胞和NIH 3T3细胞接种无胸 腺裸鼠，则能形成富含血管的肿瘤。在肝癌等许多人类恶性肿瘤组织中MK mRNA及蛋白均呈高度表达，而各种正常组织仅有低水平表达或无表达，并与 肝癌的发生、浸润转移，血管生成及预后密切相关。因此，MK可能是抗血管生 成治疗肝癌的理想靶位。近年来的研究表明， 一些小的双链RNA (dsRNA)可以高效、特异的阻断 体内特定基因表达，促使mRNA降解，诱使细胞表现出特定基因缺失的表型， 称为RNA干扰(RNAinterference， RNAi)。其作用机制主要通过dsRNA被核酸 酶切割成21 25nt的干扰性小RNA片段即siRNA，由siRNA介导识别并耙向 切割同源性靶mRNA分子而实现。在哺乳动物细胞中用siRNA能高效阻断某个 特定基因的表达，利用siRNA表达载体，无需像反义核酸那样进行广泛的化学 修饰以提高半衰期，并能在低于反义核酸几个数量级的浓度下，使目标基因表达 降到极低水平甚至完全"剔除"，从而产生缺失突变体表型，而且比基因敲除技术 更快更简单。该技术可介导哺乳动物细胞特异性基因沉默，可能成为关闭基因 的有效手段。在基因功能、基因治疗方面已显示出巨大的应用前景，并且有潜 在的药物研究和开发价值。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供对肝癌肿瘤血管生成促进因子MK基因具有较好抑制活 性的小干扰RNA序列及其化学修饰衍生物，为研发特异高效的新型抗肝癌血管生成基因治疗的新药提供基础。 本专利技术采用的技术方案是中期因子基因为靶的小干扰RNA,其特征在于所述小干扰RNA的核苷酸 序列为正义链5，-GGAUUGCGGCGUGGGUUUC-3，， 反义链 5 ,-GAAACCCACGCCGCAAUCC-3'。所述小干扰RNA序列，是根据GenBank中的核酸序列数据库，选择NCBI 公布的MidkinemRNA参考序列(GenBank序列号24475622)，通过对其进行 基于多预测RNA二级结构的计算机辅助设计，根据Ambion公司的设计工具软 件进行设计得到。通过与GenBank联机blast序列比对，所选择的靶序列均具有 很好的特异性，不会干扰人类其它正常基因的表达，其中前述序列筛选得到的 为最佳序列，其作用于人MK mRNA的第282-302位，3号外显子，该序列能 特异性抑制人HepG2肝癌细胞和人脐静脉内皮细胞的生长及肝癌肿瘤血管生成 促进因子基因MK的表达，具有成为用于抑制MK高表达的肝癌细胞生长及与 新生血管形成相关疾病的新型生物工程药物的潜力。所述小干扰RNA的核苷酸序列3'端可有2 6个dT或T修饰。优选的，所 述小干扰RNA的核苷酸序列3'端有2个dT或T修饰。优选的，所述小干扰RNA 的核苷酸序列为正义链5，-GGAUUGCGGCGUGGGUUUCtt-3 ，，反义链5'-GAAACCCACGCCGCAAUCCtt-3'。本专利技术还涉及所述的中期因子基因为耙的小干扰RNA在制备抗肿瘤药物中 的应用。包括有效成分的本专利技术的反义寡核苷酸或其修饰物以及药物学可以接 受的载体的药物组合物，本专利技术的药物组合物能用于抑制高表达MK的肝癌等 恶性肿瘤细胞的生长及与新生血管形成相关的疾病。具体的，是所述中期因子基因为耙的小干扰RNA在制备抑制高表达MK的恶性肿瘤细胞生长的药物中的应用。更为具体的，是所述中期因子基因为耙的小干扰RNA在制备抑制肝癌细胞生长的药物中的应用。或者，是所述中期因子基因为靶的小干扰RNA在制备抑制高表达MK的恶 性肿瘤新生血管生成的药物中的应用。更为具体的，是所述中期因子基因为耙 的小干扰RNA在制备抑制的肝癌新生血管生成的药物中的应用。所述的中期因子基因为靶的小干扰RNA还可应用于制备预防和治疗新生血 管异常增生的药物。本专利技术还涉及含有所述中期因子基因为靶的小干扰RNA的载体。基于所述中期因子基因为靶的小干扰RNA的特性，所述载体也同样具有上述用途。 本专利技术的有益效果主要体现在提供了特异性抑制人HepG2肝癌细胞和人脐静脉内皮细胞的生长及肝癌肿瘤血管生成促进因子基因MK的表达的siRNA序列，为新药研发提供了基础。附图说明图1为MK1、 MK2、 MK3、 MK4、 MK5、匿6转染HepG2后12， 24， 48，72h时间点的MKmRNA表达水平统计结果。图2为MK2转染HepG2细胞后MK蛋白的表达水平；1、 2、 3、 4分别代表MK2浓度5nmol/L、 50nmol/L、 500nmol/L和对照组。 图3为MK2转染HepG2细胞后对细胞增殖的影响。 图4为MK2插入pRNAT-U6.1/Neo的载体图谱。 图5为MK2-shRNA重组表达质粒插入序列的测序图谱。 图6为MK2-shRNA转染对HepG2细胞MKmRNA和蛋白表达的影响；图中1 、 2、 3、 4依次代表对照组、MK2-shRNA浓度5nmol/L、 50nmol/L、 500nmol/L组。图7为MK2-shRNA转染对HepG2/HUVEC细胞增殖的影响。具体实施例方式下面结合具体实施例对本专利技术进行进一步描述，但本专利技术的保护范围并不 仅限于此实施例l:耙向MK基因的小干扰序列的设计和筛选 1、靶向MK基因小分子干扰序列的设计与合成检索GenBank中的核酸序列数据库，选择NCBI公布的Midkine raRNA参考序 列(GenBank序列号24475622)，通过对其进行基于多预测RNA二级结构的计 算机辅助本文档来自技高网...
【技术保护点】
中期因子基因为靶的小干扰ＲＮＡ，其特征在于所述小干扰ＲＮＡ的核苷酸序列为：正义链：５’－ＧＧＡＵＵＧＣＧＧＣＧＵＧＧＧＵＵＵＣ－３’，反义链：５’－ＧＡＡＡＣＣＣＡＣＧＣＣＧＣＡＡＵＣＣ－３’。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：戴利成，姚行，王翔，杨水新，
申请(专利权)人：湖州市中心医院，
类型：发明
国别省市：33
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