【技术实现步骤摘要】
【技术保护点】
克隆有人肿瘤坏死因子－α（ＴＮＦ）基因的变铅青链霉菌的构建方法，其中包括酶切、连接、转化、挑选转化子提取重组质粒和经确证后得到所需菌种五个步骤，其特征在于：ａ、连接：以质粒Ｐ↑［ＩＪ４８６］为载体，将经过限制性内切酶ＥｃｏＲＩ－Ｈｉｎｄ Ⅲ双酶切得到的质粒Ｐ↑［ＨＴ１］ＴＮＦ↓［ｃ］ＤＮＡ片段和经过限制性内酶ＥｃｏＲＩ－ＨｉｎｄⅢ双酶切得到的质粒Ｐ↑［ＩＪ４８６］片段相连接，ｃＤＮＡ片段浓度和载体ＤＮＡ浓度比为３～５：１，加入Ｔ４ＤＮＡ连接酶，于１０～１４℃放置３小时以上进行连接，获得重组ＤＮＡ分子；ｂ、转化：采用上述ａ步骤中连接后的重组ＤＮＡ，以变铅青链霉菌ＴＫ５４的原生质体为受体，按照Ｈｏｐｗｏｏｄ等人的方法，将连接后的ＤＮＡ转化至所说的受体菌中；ｃ、挑选转化子及提取重组质粒：以含新霉素３０μｇ／ ｍｌ的Ｒ２琼脂平板挑选含重组质粒的转化子，凡是挑选出来的耐药菌落多为含重组质粒的转化子，采用Ｋａｔｚ的快速碱变性方法提取含重组质粒的转化子，酶切后的ＤＮＡ片段与在同一琼脂糖凝胶电泳平板上泳动的入噬菌体ＤＮＡ限制性内切酶ＨｉｎｄⅢ酶切片段的距离进行比较从而确定各片段分子...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李元，刘菊萍，李焕娄，石莲英，刘伯英，
申请(专利权)人：中国医学科学院医药生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]
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