人促生长因子C的改进生产方法技术

一种用来选择ＤＮＡ片段的方法，转化有这些ＤＮＡ片段的宿主可使多肽生产获得最佳效果．这些ＤＮＡ片段可储存有各种人和动物蛋白质的密码，并可使这些蛋白质在宿主细胞中表现出高效表达．在本发明专利技术的优选实施方案中，选择出具有生产人ＳＭＣ最佳效果的ＤＮＡ片段，用来表达这种生长促进因子．（*该技术在2006年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种确定DNA片段的方法，该DNA片断对转化这些DNA片段的宿主生产所需蛋白质或多肽为最适。本专利技术特别涉及到确定对生产人促生长因子C(“SMC”)为最适的并经过修饰的DNA片段。本专利技术还涉及到以这些DNA片段为特征的重组DNA分子和宿主以及使用这些DNA片段、重组DNA分子和宿主来提高人促生长因子C或来源于真核和原核生物的其它蛋白质的生产方法。人促生长因子C是一种类似于胰岛素的生长因子，在垂体分泌生长激素后，它是激发组织生长的关键蛋白质。人促生长因子C的氨基酸顺序是由E.Rinderknecht和R.E.Humble在J.Biol.Chem.，253，pp.2769-76(1978)上报道。它是由一条含有70个氨基酸的单链多肽经3个二硫键联结而成。计算出的分子量为7649。促生长因子C的结构与胰岛素前体很相似，例如，促生长因子C第1-29个氨基酸相当于胰岛素B链，第42-62个氨基酸相当于胰岛素A链。然而，促生长因子C中的联结链却与胰岛素前体的C肽链不相似，促生长因子C还有1个在胰岛素前体中不存在的位于C端的8肽。促生长因子C在体外表现出强烈的生长促进作用，如它能促进DNA、RNA、蛋白质和糖蛋白的合成〔E.Rinderknecht and R.E.Humble，Proc.Natl.Acad.Sci USA，73，pp.2365-69(1976);B.Morell and E.R.Froesch，Eur.J.Clin.Invest.，3，pp.119-123(1973);E.R.Froesch et al.，Adv.Mental.Disord.，8，pp.211-35(1975);A.E.Zingg and E.R.Froesch，Diabetologia，9，pp.472-76(1973);E.R.Froesch et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，73，pp.2904-08(1976)〕。它还能促进鸟氨酸脱羧酶和细胞增殖〔B.Morrel and E.R.Froesch，supra;G.K.Haselbacher and R.E.Humble，J.Cell.Physiol.，88，pp.239-46(1976)〕。在生物体内，促生长因子C有促进因垂体切除而造成的生长激素缺乏症的老鼠生长的作用。〔E.Schoenle.et al.，Nature.296，pp.252-53(1982)〕象生长激素一样，促生长因子C也有一定程度的物种特异性。然而，从一种生物提出的促生长因子C对在进化地位较低的种类可以具有生物学活性，例如，人们相信人促生长因子C在促进牛、猪和鸡的生长中有一定的作用。对实验动物，促生长因子C表现出来的促进生长作用与天然人生长激素的作用相同。但是，人们认为促生长因子C优于人生长激素，因为促生长因子C是生长反应中的中枢调节因子。因此，同生长激素相比，促生长因子C是生长的更加直接的调节因子。促生长因子C除了可以治疗某些形式的生长失调如侏儒症、肌肉萎缩外，还可用于刺激特殊部位的组织生长，如伤口愈合、组织损伤和骨折的愈合。然而，由于促生长因子C只能从人类血液中提取，得到的数量很少，它作为组织生长促进因子在医学上的可能应用受到很大限制。因而，需要用其它方法来制取具有商业和医用价值的足够多的促生长因子C。一种方法是利用重组DNA技术，将编码促生长因子C的DNA片段转化到宿主中，由宿主来生产促生长因子C。然而，由于转化后的各种大肠杆菌宿主的促生长因子C表达产量很低，从经济上考虑无法进行商业生产。本专利技术对上述问题的解决方法是用一种方法来确定这样的DNA片段，该片段对转化有这些DNA片段的宿主生产促生长因子C或其它所需原核、真核生物蛋白质或多肽为最适。经过这个方法选择出来的经过修饰的DNA片段编码这些蛋白质的表达一具体在本专利技术优选实施方案为促生长因子C，并且可在各种宿主中进行有效的高水平生产。因此，借助于本专利技术的方法，人类有可能首次得到具有促生长因子C的促进和调节生长作用的多肽，并且其数量足以供应医学应用所需。以下的描述将说明，按本专利技术的优选实施方案，本专利技术的新DNA片段和重组DNA分子能够在合适的宿主内生产出大量的促生长因子C或类似于它的多肽。由此获得的多肽在人、牛、猪和鸡体内具有广泛的促进和调节生长的作用。还可看到，本专利技术的一个基本要求是计设一个方法来确定在促生长因子C、其它所需原核或真核生物蛋白及多肽的生产中具有最佳效果的DNA片段。另一基本要求是关于能够增加这些蛋白质特别是促生长因子C或其类似多肽产量的各种新DNA片段、重组DNA分子和宿主。大概地讲，本专利技术之对在用编码所需蛋白或多肽的DNA片段所转化的宿中生产所需真核或原核生物蛋白或多肽的改进方法包括下列步骤将编码一种易分析蛋白质或多肽的DNA片段之N端的一部分，用编码所需原核或真核生物蛋白质或多肽N端一部分的DNA片段的一系列降解产物来取代;使得到的一系列杂种DNA片段与合适的表达控制片段联结，在适宜的宿主内表达;选择出使易分析蛋白质或多肽生产达到最佳效果的杂种DNA片段，并且应用那些所选择出的杂种DNA序列的N末端部分，其在所需多肽或蛋白的表达中编码所需多肽或蛋白的N末端部分。该方法使所需蛋白或多肽的生产达到最适。图1表明了如何制备编码f-Met-SMC(甲酰甲硫氨酸促生长因子C，以下用SMC代表促生长因子C)的合成DNA片段和如何制备pLc24-muSMCori质粒的简要轮廓，pLc24muSMCori′质粒含有的该DNA片段位于来自mu噬菌体和PL启动子的片段下游。图2表示两个片段SMC A和SMC B的合成核苷酸顺序(都是双链)，这两个片段在本专利技术的一个方法实例中用于制备编码f-Met-SMC的DNA片段。图2还表明了片段SMC A和SMC B的氨基酸顺序和1-11、X、Y和Z等用以制备这两个片段所需的各个多聚核苷酸顺序。图3表示一个制备质粒pUCmuSMC Aori′，pUCmuSMC A1-18和pUCmuSMC1-18的简单轮廓。图3中部表示的512次降解合成连接子的顺序中，“N”代表所有4种可能的碱基，“P”代表嘌呤，“Y”代表“嘧啶”。下面，对本专利技术的详细说明将有助于对本专利技术的充分理解。在说明中，使用了以下术语核苷酸DNA或RNA的单位，由糖分子(戊糖)、磷酸分子和-含氮杂环碱基组成。碱基与糖苷碳(戊糖的1′碳)相连，形成的结合物叫核苷。每一核苷酸的性质取决于其所含有的碱基。DNA中的4个碱基为腺嘌呤(“A”)、鸟嘌呤(“G”)、胞嘧啶(“C”)和胸腺嘧啶(“T”)，RNA中的4个碱基为A.G.C和尿嘧啶(“U”)。DNA片段 核苷酸的线性排列，各核苷酸之间是通过磷酸二酯键将相邻二个戊糖分子的3′碳和5′碳联结而成。密码子 含有三个核苷酸的DNA片段(三联体)，通过RNA编码一个氨基酸，转译起始信号或转译终止信号。基因 一段DNA片段，它通过它的模板即mRNA编码出代表特定多肽的氨基酸序列。转录 从基因形成mRNA的过程。转译 本文档来自技高网...

【技术保护点】
将编码拟制多肽的ＤＮＡ片段经人工操作与表达控制片段连结后，转化到宿主中来提高这种多肽生产的方法，该方法包括下述步骤：将编码一种易分析多肽Ｎ端一部分的ＤＮＡ片段，用编码拟制多肽Ｎ端一部分的ＤＮＡ片段的一系列降解产物来取代，该取代并不影响易分析多肽的易分析性，使得到的一系列杂种ＤＮＡ片段与合适的表达控制片段经人工操作相连，在宿主内表达；选择出使易分析多肽产生达到最佳效果的杂种ＤＮＡ片段；选择出的杂种ＤＮＡ片段储存有拟制多肽Ｎ端一部分的密码，将此杂种ＤＮＡ片段的Ｎ端那部分用来表达拟制多肽。

【技术特征摘要】
GB 1985-3-26 8507833而不是用前面的列举具体例证的方法来限定本发明的涉及范围。权利要求1.将编码拟制多肽的DNA片段经人工操作与表达控制片段连结后，转化到宿主中来提高这种多肽生产的方法，该方法包括下述步骤将编码一种易分析多肽N端一部分的DNA片段，用编码拟制多肽N端一部分的DNA片段的一系列降解产物来取代，该取代并不影响易分析多肽的易分析性使得到的一系列杂种DNA片段与合适的表达控制片段经人工操作相连，在宿主内表达；选择出使易分析多肽产生达到最佳效果的杂种DNA片段；选择出的杂种DNA片段储存有拟制多肽N端一部分的密码，将此杂种DNA片段的N端那部分用来表达拟制多肽。2.根据权项1所述的方法，其特征在于从β-半乳糖苷酶、半乳糖激酶和具有抗药标志物中来选择出所述的易分析多肽。3.根据权项1所述的方法，其特征在于，拟制多肽选自动物或人的干扰素、白细胞介素和其它淋巴因子、血液因子、酶、病毒抗原、SMC、生长激素和其它激素及多肽。4.根据权项1所述方法，其特征在于，表达控制片段选自lac系统，trp系统，tac系统，trc系统，λ噬菌体的主要操纵子和启动子区域，fd外壳蛋白质的控制区域，SV40早期和晚期启动子，来自多形瘤、腺病毒和猿病毒的启动子，酵母蛋白质水解酶的启动子，酵母α-配对因子和酵母酸性磷酸酶的启动子。5.根据权项1所述的方法，其特征在于所述的宿主选自大肠杆菌各种菌株，假单胞菌属，杆菌属，链霉菌属，酵母，其它真菌，动物和植物细胞。6.根据权项1所述的方法，其特征在于所述的DNA片段储存有类似SMC多肽密码，并且是从pLC24muSMC1至pLC24muSMC10的DNA插入片段中选择而来。7.储存有拟制多肽密码的DNA片段，此片段是由包括下列步骤的方法制备而来将储存有一种易分析多肽密码的DNA片段N端的一部分用储存有拟制多肽N端一部分的密码的DNA片段的一系列降解产物来取代，该取代基本不影响分析蛋白质的易分析性;使得到的一系列杂种DNA片段与合适的表达控制片段经人工操作相连，在宿主内表达;选择出使易分析多肽产生达到最佳效果的杂种DNA片段;把储存有拟制蛋白质密码的D...

【专利技术属性】
技术研发人员：加里N布尔，纳吉斯瓦拉罗莫瓦，
申请(专利权)人：拜奥根公司，
类型：发明
国别省市：NL[荷兰]