新构建的L-天门冬酰胺酶工程菌及其发酵培养制造技术

本发明专利技术是关于新构建的产Ｌ－天门冬酰胺酶重组菌及其发酵培养的方法。其中包括：从产Ｌ－天门冬酰胺酶的菌株中分离染色体ＤＮＡ，引物的设计，用ＰＣＲ方法钓取酶的基因，酶基因的序列测定，重组质粒的构建，在几种宿主菌的表达，工程菌的发酵培养。本方法中，所得到的酶基因区别于已报道的该酶基因序列，并在个别氨基酸组成上也有差异；工程菌所采用的培养基便宜易得，发酵方法简单可行，每毫升发酵液可达１２０－２２８单位。（*该技术在2018年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术是关于新构建的L-天门冬酰胺酶工程菌及其发酵培养方法。本专利技术是利用现代生物技术、基因工程方法来构建工程菌，并选择合适的培养基及培养方法使得到的酶活力达到最高水平。L-天门冬酰胺酶，也称L-天门冬酰胺基水解酶，能专一地催化L-天冬酰胺水解成L-天冬氨酸和氨。1953年，Kidd发现豚鼠血清有抗肿瘤作用，到了六十年代，Broome证实了豚鼠血清的抗肿瘤因子是血清中的L-天门冬酰胺酶。L-天冬酰胺酶能使敏感肿瘤细胞氨基酸、蛋白质和核酸代谢的紊乱，从而抑制肿瘤生长。1964年，Mashburn从大肠杆菌分离得到该酶，从此开始了从微生物中提取L-天门冬酰胺酶，进行生产及临床的研究。许多临床资料表明L-大门冬酰胺酶对急性淋巴细胞白血病、急性粒细胞白血病、急性变慢性白血病以及若干实质性肿瘤有肯定的治疗作用，特别对儿童急性淋巴细胞白血病有很好的疗效。我们实验室于1970年开始L-天门冬酰胺酶研究，筛选出一株高产L-天门冬酰胺酶的大肠杆菌菌株，经过发酵培养条件试验，酶活力达到4.6iu/ml，以后进行纯化、工厂中试、纯化酶制剂的动物试验、临床试验，在1973年通过了鉴定，并开始在天津生化制药厂进行生产，在医院里得到了应用。此后，我们用甲基戊二醇方法获得了该酶的结晶，并对该酶作了一系列的性质试验，酶的分子量是144000，由四个相同的亚基组成，单独的亚基不具备酶活性，酶的等电点是pI4.6，酪氨酸残基是该酶活性的必需基团，处于该酶分子的活性部位，对酶分子的N-端氨基酸组成进行了分析。虽然，L-天门冬酰胺酶已使用多年，但在治疗白血病方面，该酶仍被认为是一个有效的药物，只是在应用中产生了一些问题，如作为异体蛋白的酶的长期使用会刺激免疫系统，对人体产生有害的免疫排斥反应，酶在人体中不稳定性，半衰期短；更为重要的是，菌种产酶活性低而引起酶制剂成本太高，一般病人根本承受不起，这些问题不解决，就会大大限制了酶的广泛使用。提高菌种产酶能力，可以用多种方法，包括重新筛选优良菌种、通过传统的物理化学的方法进行菌种诱变以及用现代遗传育种技术、基因工程方法来提高菌种的产酶能力等。但是通过国内外专利及文献检索，发现的基因工程方面的报道很少，还没有用工程菌来生产该酶。英国的PublicHealth Laboratory Service Board的Atkinson博士从欧文氏菌(Erwinia chrsyanthemi)的DNA基因库中筛选出L-天门冬酰胺酶基因，构建的重组质粒pASN30，在大肠杆菌和欧文氏菌中进行表达。酶的表达量仅为可溶性蛋白的5-6％，酶活力最高只有20iu/ml.该酶的亚基分子量为32000，等电点pI8.5(EP211639)。美国Purdue大学的Harms博士也构建了产L-天门冬酰胺酶的大肠杆菌工程菌(Protein ExpressionPurification,1991 2(2-3),44-50).所分泌出的酶占细胞可溶性蛋白的10-15％。每立升发酵液能得到10-15mg酶。在国内，中国药科大学的刘景晶等人先后构建了二个产L-天门冬酰胺酶的工程菌。在第一个工程菌中，产酶量仅为6.2-31.8iu/ml，酶蛋白占28.3-35.7％(药物生物技术1995,2(4)8-15)。而在第二个工程菌中，使用了同一个酶的基因来源，但构建在不同的表达载体里，使表达水平有了很大提高，在LB培养基里，能达到106iu/ml。只是在1.5L的生物反应器，酶活力高达400iu/ml。酶蛋白占菌体可溶性蛋白48.3％。酶的分子量为140000。(中国药科大学学报，1996,27(11)696-700)。但这些工作离酶的生产应用仍有很大一段距离，因为所采用的表达质粒含Tac启动子，需要有价格昂贵的IPTG诱导及氨苄青霉素作为选择标记，而在大规模生产时，加上IPTG和氨苄青霉素显然是不合适的。本专利技术的目的是构建一株高产L-天门冬酰胺酶的工程菌，其发酵培养基易得，培养方法简单可行，不需化学诱导剂诱导及氨苄青霉素作为选择标记，易于工业化生产，产酶能力强，从而大大降低生产成本，提高经济效益。本专利技术的L-天门冬酰胺酶工程菌的构建及发酵培养方法，包括如下一些工艺步骤从产L-天门冬酰胺酶的菌株中分离染色体DNA、引物设计和用PCR方法钓取酶的基因、基因序列测定及重组质粒的构建、重组质粒在几种宿主菌中表达、工程菌的发酵培养。本专利技术重组质粒的构建及工程菌的培养方法的上述各步详细内容如下1．从产L-天门冬酰胺酶的菌株中分离染色体DNA产L-天门冬酰胺酶的原始菌株，是由本专利技术人在实验室筛选而得。是几年前筛选出的一株高产L-天门冬酰胺酶的大肠杆菌菌株，后由天津生化制药厂试生产。该菌种名叫IM-602，在7.5％玉米浆，37℃培养8小时，其产L-天门冬酰胺酶的酶活力每毫升培养液最高能达到4.6单位。从上述菌种中分离提取染色体DNA的方法，是采用已知技术，详见“DNA探针技术”(美国G.H.凯勒和M.M.马纳克著，孙士勇等人译，科学出版社，1992年出版)。该方法主要是将37℃培养过夜的IM-602培养液离心收集菌体，加溶菌酶至终浓度1mg/ml,0℃作用15min，加RNase至终浓度100μg/ml,37℃ 30min，加蛋白酶K至终浓度100μg/ml，37℃ 2小时后用苯酚∶氯仿(1∶1)将蛋白抽提5-6次，移出水相，加入3mol/L乙酸钠至终浓度为0.2mol/L，加入-20℃预冷的无水乙醇，界面形成云雾状沉淀，即沉淀的DNA，用玻棒顺时针缠绕，放至4℃ TE缓冲液中逆时针解旋下DNA，即得到提取的染色体DNA。2．引物设计和用PCR方法钓取酶的基因制备重组质粒重组质粒的L-天门冬酰胺酶的基因是通过已知PCR方法从上述染色体DNA中扩增而得到。两个引物是根据已报导的大肠杆菌L-天门冬酰胺酶的基因序列及表达质粒的多酶切点而设计的，EcoRⅠ在酶基因的5’端，并在其后设置起始密码子ATG,SalⅠ在酶基因的3’端。其中primer-1:5’-TAGAATTCATGGAGTTTTTCAAGAAGACG-3’primer-2:5’-AAGTCGACATTAGTACTGATTGAAGATC-3’两个引物所设置的酶切位点与表达质粒PBV220的EcoRⅠ和SalⅠ相匹配，适合于在大肠杆菌中高表达。表达质粒pBV220经过用EcoRⅠ和SalⅠ酶切，酶切产物经低熔点胶电泳，切下所需的带，进行纯化。纯化的经EcoRⅠ和SalⅠ酶切的酶基因片段在DNA连接酶作用下，连接在pBV220/EcoRⅠ+SalⅠ，转化在JM105中，从菌落中提取质粒，用EcoRⅠ,SalⅠ进行酶切鉴定。挑出二个含L-天门冬酰胺酶基因的重组质粒，并命名为pASN(见附附图说明图1)。附图1是本专利技术工程菌重组质粒pASN的构建图。重组质粒经EcoRⅠ和SalⅠ酶切为大小二个片段，其大小分别与酶基因和pBV220/EcoRⅠ+SalⅠ的片段大小相一致。PCR反应染色体DNA模板1.5μg,2.5单位Taq聚合酶，100pmol DNA引物，2.5mM dATPdCTPdGTP和dTTP各1μl，终体积25μl，每循环中94℃变性45s,45℃退火1min,72℃延伸1min本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种产Ｌ－天门冬酰胺酶的工程菌，其特征在于：１）该工程菌是由重组质粒ｐＡＳＮ在三种宿主菌ＴＧ１、ＪＭ１０５、ＩＭ６０２分别转化而得，２）该工程菌在合适的培养基、合适的培养条件下，具有强的产Ｌ－天门冬酰胺酶的能力，其酶活力为１２０－２ ２８国际单位／毫升发酵液，３）该工程菌产生的酶不同于已有的大肠杆菌Ｋ－１２，酶的分子量为１４４０００，由四个相同亚基组成，亚基基因全长为１０４４ｂｐ，其中有３３个碱基不同于大肠杆菌Ｋ－１２，所编码的氨基酸中二个有差别（Ａｌａ↓［２７］和 Ａｓｎ↓［２６３］）。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：钱世钧，王颖达，孟广震，叶军，
申请(专利权)人：中国科学院微生物研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]