一种高效生产BPI-Fc重组蛋白的方法技术

本发明专利技术公开了采用原核表达系统表达由杀菌／渗透性增强蛋白（ＢＰＩ）与免疫球蛋白重链恒定区（Ｆｃ）嵌合组成的ＢＰＩ－Ｆｃ重组蛋白的高效生产方法，包括（１）、构建ＢＰＩ－Ｆｃ嵌合基因表达载体；（２）、ＢＰＩ－Ｆｃ重组蛋白在原核宿主细胞中表达；本发明专利技术还公开了在原核表达系统表达ＢＰＩ－Ｆｃγ１重组蛋白过程中的特异表达载体；本发明专利技术对研制新型高效抗感染生物制剂具有重要价值，在制药行业具有广阔的应用前景。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及基因工程领域重组蛋白的高效生产方法及其应用。细菌耐药是临床抗感染治疗中遇到的最为严重和棘手的问题，迄今尚未获得有效的解决办法。来自临床的研究报导指出，感染患者中约半数以上为革兰氏阴性(G-)菌感染，其中发展为G-菌败血症(GNS)引起休克死亡的比率也相对较高。目前传统抗菌素治疗和采用抗脂多糖类脂A/内核心单克隆抗体或抗IL-1/TNF单克隆抗体进行免疫治疗，效果均不理想。杀菌/渗透增强蛋白(Bactericidal/Permeability Increasing Protein,BPI)是在多形核白细胞中发现的一种56kd的阳离子抗菌糖蛋白，随后重组BPI及其N端功能片段相继研制成功。研究表明，上述重组蛋白与天然BPI具有完全相同的生物功能，即对细菌脂多糖和类脂A有很高的亲合力，它们不仅能非特异性杀伤G-菌，并可中和其内毒素，具有广阔的临床应用前景。但初步应用结果表明，重组BPI及其N端功能片段作为抗感染生物制剂，易被蛋白酶降解而不稳定，在体内血清半衰期短(小于60分钟)，因而影响其临床疗效。Ig样重组蛋白是应用基因工程技术产生的由某种蛋白或功能多肽片段与免疫球蛋白(Ig)或其重链恒定区(Fc)片段嵌合组成的杂合蛋白，它不仅不易被蛋白酶降解、稳定性好、在血清中半衰期长，而且具有该种蛋白或功能多肽所特有的生物功能，并具有免疫球蛋白的激活补体和调理作用等特性。由BPI或其N端功能片段与免疫球蛋白Fc片段或其等位体嵌合组成的Ig样重组蛋白(称为BPI-Fc)，在具备较好稳定性和较长血清半衰期的同时，具有BPI广谱杀伤G-菌和中和内毒素作用，并可通过Fc激活补体和调理作用增强BPI的杀菌作用，是一种理想的新型非抗生素类抗感染生物制剂。Ig样重组蛋白具有分子较大、二硫键多、结构和功能复杂等特点，一般均采用真核表达系统表达，以便通过糖基化修饰和自然折叠，产生具有天然蛋白或其功能片段生物功能的糖基化重组蛋白；但真核表达系统存在表达量低、成本高等问题，因而影响其实际应用。BPI或其功能片段和Fc片段上均有糖基化位点，而原核宿主细胞不对表达的蛋白进行糖基化修饰，迄今未见采用原核表达系统生产BPI-Fc重组蛋白的报导。但原核表达系统具有表达量高、成本低等优势。本专利技术的目的是提供一种采用原核表达系统表达BPI-Fc重组蛋白的高效生产方法。本专利技术的技术方案为一种BPI-Fc重组蛋白的高效生产方法，包括以下步骤(1)、构建BPI-Fc嵌合基因表达载体；(2)、BPI-Fc重组蛋白在原核宿主细胞中表达。所述表达载体是包含由BPI或其功能片段基因和免疫球蛋白重链恒定区Fc或其等位体基因嵌合组成的BPI-Fc嵌合基因，并能在原核宿主细胞中表达BPI-Fc重组蛋白的DNA。所述BPI-Fc嵌合基因为BPI-Fcγ1嵌合基因，由BPI1-199功能片段基因和人IgG1重链恒定区Fcγ1基因嵌合组成，其中连接5’端BPI1-199功能片段基因与3’端Fcγ1基因的铰链区核苷酸序列描述为5’…GAAGCTTCTAC…3’；在5’端BPI1-199功能片段基因前加入含EcoRⅠ位点和起始密码ATG的核苷酸序列为5’GAATTCATG 3’；在3’端Fcγ1基因后采用TAA作为终止密码。所述的在原核宿主细胞中表达是将表达载体转化原核宿主细胞并诱导表达BPI-Fc重组蛋白。所述原核宿主细胞为大肠杆菌。所述大肠杆菌为E.coli DH5α。BPI-Fc重组蛋白在原核宿主细胞中表达后，用亲和层析方法提纯BPI-Fc重组蛋白。本专利技术的另一个目的是提供一种高效生产BPI-Fc重组蛋白的表达载体。本专利技术的这一目的是这样实现的一种高效生产BPI-Fc重组蛋白的表达载体，它是包含由BPI或其功能片段基因和免疫球蛋白重链恒定区Fc或其等位体基因嵌合组成的BPI-Fc嵌合基因，并能在原核宿主细胞中表达BPI-Fc重组蛋白的DNA。所述的BPI-Fc嵌合基因为BPI-Fcγ1嵌合基因；所述的BPI-Fcγ1嵌合基因由BPI1-199功能片段基因和人IgG1重链恒定区Fcγ1基因嵌合组成，其中连接5’端BPI1-199功能片段基因与3’端Fcγ1基因的铰链区核苷酸序列描述为5’…GAAGCTTCTAC…3’。所述BPI-Fcγ1嵌合基因编码的BPI-Fcγ1重组蛋白N端BPI1-199功能片段与C端Fcγ1片段的铰链区氨基酸序列描述为…:EAS:TCPPCPAPELL…。所述BPI-Fcγ1嵌合基因中在5’端BPI1-199功能片段基因前加入含EcoRⅠ位点和起始密码ATG的核苷酸序列为5’GAATTCATG3’。所述BPI-Fcγ1嵌合基因在3’端Fcγ1基因后采用TAA作为终止密码。本专利技术应用基因工程技术在原核宿主细胞中高效表达了BPI-Fc重组蛋白，表达产生的重组蛋白是非糖基化重组蛋白，经实验验证，首次发现原核表达系统表达产生的非糖基化BPI-Fc重组蛋白具有BPI的生物功能和Fc的生物功能，可通过激活补体和调理作用极大增强杀伤G-菌的作用。因此本专利技术对研制新型高效抗感染生物制剂具有重要价值，在制药行业具有广阔的应用前景。下面结合附图对本专利技术作进一步说明。附图说明图1为Sepharose CL-4B Protein A亲和层析提纯BPI-Fcγ1的单一洗脱峰图2为亲和层析纯化的BPI-Fcγ1的SDS-PAGE电泳分析图3表示补体对BPI-Fcγ1重组蛋白杀伤G-菌的增强作用图4表示白细胞对BPI-Fcγ1重组蛋白杀伤G-菌的增强作用实施例一、BPI功能片段基因和Fcγ1片段基因的克隆1．BPI功能片段基因的克隆从早幼粒细胞白血病HL-6细胞系(ATCCCCL240)中提取mRNA，用设计合成的人BPI基因引物(P1 5’CAGAATTCATGGTCAACCCTGGCGTCGTG3’和P2 5’GCAAGCTTCTATTTTGGTCATTACTGGCAG3’)进行RT-PCR扩增(48℃逆转录45分钟后进行35个循环PCR扩增，循环参数为94℃变性30秒、53.5℃复性40秒、72℃延伸45秒)，得到约620bp的BPI基因片段BPI620；用EcoRⅠ/Hind Ⅲ双酶切BPI620得到约200bp的BPI基因片段BPI200(EcoRⅠ/EcoRⅠ粘性末端)和约420bp的BPI基因片段BPI420(EcoRⅠ/HindⅢ粘性末端)；按照分子克隆操作方法，将BPI200和BPI420分别克隆到PUC18质粒的EcoRⅠ位点和EcoRⅠ/HindⅢ双酶切位点上得到PUC18-BPI200和PUC18-BPI420。2．Fcγ1片段基因的克隆从正常人外周血白细胞中提取mRNA，用设计合成的人IgG1的Fcγ1片段基因引物(P3 5’GTAAGCTTCTACATGCCCACCGTGCCCAG3’和P4 5’TCGGATCCTTATTTACCCGGAGACAGGGAG3’)进行RT-PCR扩增(48℃逆转录45分钟后进行35个循环PCR扩增，循环参数为94℃变性30秒、56℃复性40秒、72℃延伸45秒)，得到约700bp的Fcγ1基因片段Fcγ1700；Fcγ1700经HindⅢ/BamHⅠ双酶切后克隆到PUC18的HindⅢ/B本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种ＢＰＩ－Ｆｃ重组蛋白的高效生产方法，包括以下步骤： （１）、构建ＢＰＩ－Ｆｃ嵌合基因表达载体； （２）、ＢＰＩ－Ｆｃ重组蛋白在原核宿主细胞中表达。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：安云庆，陈金栋，
申请(专利权)人：首都医科大学，陈金栋，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]