生产内皮抑制素的方法技术

本发明专利技术涉及生产内皮抑制素的方法，特别是涉及使用原核表达系统，以提高的表达效率和产率生产重组人内皮抑制素的方法。本发明专利技术的方法在提高表达效率的基础上大大提高了人内皮抑制素蛋白的产率，同时简化了表达产物的纯化步骤及复性后蛋白质活性的保留，从而大大降低了大批量生产用于临床前检验及临床试用所需的人内皮抑制素的生产成本。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及，特别是涉及使用原核表达系统，以提高的表达效率和产率生产重组人内皮抑制素的方法。本专利技术的方法在提高表达效率的基础上大大提高了人内皮抑制素蛋白的产率，同时简化了表达产物的纯化步骤及复性后蛋白质活性的保留，从而大大降低了大批量生产用于临床前检验及临床试用所需的人内皮抑制素的生产成本。血管生成(即从已有血管长出新的毛细血管)对于胚胎发育、器官形成，组织再生及创伤修复是不可缺少的(Folkman.J.and Shing,Y.J.Biol.Chem.267:10931-10934.1992；Folkman,J.,Nature Medicine 1:27-31,1995)。同时，血管生成又是导致肿留生长和转移、心血管疾病、糖尿病性视网膜病变、类风湿性关节炎等许多病理条件发展与恶化的必要因素。血管生成是一个包括内皮细胞增殖、迁移和分化、细胞外基质降解、微管形成及芽生新的毛细血管等多个步骤的，并且有一系列调节因子参预的过程。已发现并鉴定的血管生成刺激因子包括血管内皮细胞生长因子(VEGF)、血管通透因子(VPF)、成纤维细胞生长因子(FGF-2和-1)等。另一方面，迄今也已发现并鉴定了纤连蛋白、层粘连蛋白、转化因子β1、血小板反应蛋白1、血小板因子4、催乳素等血管生成抑制因子。特别是近年来，O′Reilly等人(O′Reilly,M.S.et al.,Cell79:315-328,1994.′Reilly,M.S.et al,Cell 88:277-287,1997)先后发现并鉴定了作为纤溶酶原之内部片段和胶原蛋白XⅧ之C末端20KDa球形区的血管生成抑制素和内皮抑制素。从已有研究结果可以预想到，组织中血管生成表型的开放与关闭将取决于组织局部区域血管生成刺激因子和抑制因子间的动态平衡(参见Folkman,J.,N.Engl.J.Med.333:1757-1763,1995)。特别令人感兴趣的是，近年来的研究显示，上述血管生成抑制因子大都是在对其各自的来源分子进行蛋白质水解并形成末端或内部片段之后，才表现有内皮细胞增殖抑制活性的。因此，推测蛋白质的内源蛋白酶裂解可能对其生物学活性的发挥起着关键性作用(参见O′Reilly,M.S.etal.,Cell 88；277-285,1997)。这一现象以及以前发现的某些生物学活性蛋白质的内部或侧翼片段具有与该蛋白质的完整分子相反的生物学活性；以及酶原只有在某些特定组织内的特定生化过程中才能转化成活性酶蛋白的现象，可能代表了生物体进化过程中所建立的复杂的保护、应激及适应机制。作为胶原蛋白XⅧ的20KDa羧基本末端片段，内皮抑制素是内皮细胞增殖和迁移的一种特殊抑制剂，并可显著地抑制小鼠多种原发性肿瘤的生长(O′Reilly,M.S.et al.,Cell88:277-285,1997和USP5.854,205)。并已显示，重复使用内皮抑制素可使小鼠肿瘤处于持久的休眠状态，而且没有诱发药物抗性(Boehm,T.et al.,Nature 390:404-407,1997)。最近的研究进一步显示，内皮抑制素导致细胞静止在生长周期的G1期并特异地诱导内皮细胞的凋亡(Dhanabal,M.et al.,Biochem.Biopys.Res.Commun.258:345-352,1999)。内皮抑制素最初是根据其具有抑制毛细血管内皮细胞增殖的能力，而由培养的血管内皮细胞瘤细胞系中分离的(O′Reilly,M.S.et al.,Cell88:277-285,1997)。在分析其核苷酸编码序列的基础上，O′Reilly等人进一步利用大肠杆菌表达系统表达了沉淀的并且未复性的内皮抑制素蛋白，并认为未复性的纯化蛋白质有利于在皮下注射部位延迟释放。作者提到，当以标准方法使内皮抑制素重新折叠并溶于组织培养基中后，即可强有力地抑制内皮细胞增殖。但不幸的是，蛋白质重折叠过程中造成蛋白质的显著丢失。鉴于该产物能够延长用药后的抗肿瘤活性，因而推测内皮抑制素可在体内逐渐恢复天然构象并延长发挥抗血管生成活性的时间。现有技术也报导了使用酵母(巴斯德毕赤酵母)系统克隆和表达可溶形式的重组内皮抑制素的方法(Dhanabal,M.et al.,Cancer Res.59:189-197,1999)。另外，尽管报导了可在原核系统中表达有血管生成抑制活性形式的蛋白质，但产物却很难重折叠成可溶的蛋白质，而是倾向于从溶液中沉淀析出。再者，还有人在其他真核细胞系，如NS/O小鼠骨髓瘤细胞系中表达了作为Fc-内皮抑制素融合蛋白的内皮抑制素(Lo,K.-M.et al,Protein Eng.11:495-500 1998)，在人胚胎肾细胞中以高水平表达了可溶形式的小鼠内皮抑制素(Hohenester,E.et al.,EMBO J.17(6):1656-1664,1998)，以及使用修饰的附加型表达载体在293人肾细胞中表达了小鼠和人内皮抑制素(Kohfeldt,J.F.,FEBS Lett.,16:908-916,1997)。鉴于内皮抑制素作为肿瘤生长抑制剂使用时的临床前研究及临床试用的用量很大，而大肠杆菌表达产物又难以复性和易于形成沉淀的问题，目前大多倾向于使用酵母系统大批量生产分泌形式的重组人内皮抑制素。然而，使用巴斯德毕赤酵母表达系统不仅生产设备投资巨大(如使用大至10吨或10吨以上发酵罐)，而且也存在因污染而遭受巨大损失的危险。因此，有必要进一步提供一种改良的，以更高的产率和更简单的纯化工艺生产重组人内皮抑制素的方法。本专利技术的一个目的是提供编码带有N末端附加氨基酸序列的人内皮抑制素的核苷酸序列，特征在于如果不考虑密码子的简并性，其中所说的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的序列，其中所示的Xaa+代表编码中性氨基酸的密码子或不存在。根据本专利技术这一目的的一优选实施方案，其中所说的编码附加氨基酸的核苷酸序列是在制备人内皮抑制素核苷酸编码序列的过程中，以与所说的编码序列直接相连的方式得到的。本专利技术的另一个目的是提供一种以提高的表达产率和简化的纯化步骤生产带有N末端附加氨基酸序列的内皮抑制素的方法，该方法包括(1)提供3′末端直接连接有如SEQ ID NO:1所示的寡核苷酸序列的人内皮抑制素核苷酸编码序列(2)将步骤(1)得到的完整核苷酸序列连接到适当的表达载体中，以得到重组表达载体；(3)将步骤(2)得到的重组载体转化到适当的大肠杆菌宿主中，并在适于表达由(1)中所述的核苷酸序列编码的人内皮抑制素的条件下，培养被转化的宿主细胞；(4)从细胞培养基中和细胞内回收并纯化所需的表达产物。根据本专利技术这一目的的一个优选实施方案，其中所说的表达产物的N末端氨基酸是甘氨酸(Gly)。根据本专利技术这一目的的一个优选实施方案，其中所说的表达载体是携带T7启动子的pET质粒或其衍生物。根据本专利技术这一目的的一个优选实施方案，其中所说的表达载体是pET25B。根据本专利技术这一目的的一个优选实施方案，其中所说的大肠杆菌宿主是大肠杆菌BL21(DE3)细胞系。根据本专利技术这一目的的一个优选实施方案，其中所说的表达产物是N末端带有(Met)GlyGlyXaaHisHisHisHisHis附加氨基酸序列的人内皮抑制素，其中Xaa代表本文档来自技高网...

【技术保护点】
编码带有Ｎ末端附加氨基酸序列的人内皮抑制素的核苷酸序列，特征在于如果不考虑密码子的简并性，其中所说的核苷酸序列如ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１所示的序列，其中所示的ＸＸＸ代表编码中性氨基酸的密码子或不存在。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：罗永章，周兵，
申请(专利权)人：烟台荣昌生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：37[中国|山东]