一种培养发菜细胞的方法技术

本发明专利技术公开了一种培养发菜细胞的方法，１．培养液的配制：将配制好的贮藏液加入水中的顺序是，硝酸钠、磷酸氢二钾、七水硫酸镁、二水氯化钙、九水硅酸钠、微量金属元素溶液ＰＩＶ、土壤浸出液按比例配制；２．藻细胞匀浆的制备，首先将野生发菜丝状体用乙醇和蒸馏水洗涤，无菌培养液浸泡８－１０ｈ；其次是用玻璃匀浆器将丝状体匀浆破碎，匀浆液用于细胞培养；３．藻种无菌纯化；４．藻细胞培养；５．实时监控；６．收获；７．干燥；８．继续培养。本发明专利技术方法简单，操作方便，安全无污染，生长周期短，生产效率高，营养成分全面，营养含量高，广泛适用于城乡规模化生产培养。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及生物
，更具体涉及。
技术介绍
念珠藻是蓝藻门Cyanophyta蓝藻纲Cyanophyceae段殖藻目Hormogonales念珠藻科Nostocaceae的一类分布地域广、生态环境复杂、形态结构多样的藻类类群，其植物体胶状或革状，成熟植物体有球形、叶状、丝状、泡状等多种形状，中空或实心，营漂浮或着生生长。念珠藻是许多极端环境中的主要组成种类，在高温、严寒、强紫外线照射、极低光照强度、高盐度等极端环境中都可以发现念珠藻的踪迹，其中的一些种类如发菜(Nostoc flagelliforme)、地木耳(Nostoccommune)、葛仙米(Nostoc sphaeroides)营养丰富可供食用，并具有一定的药用价值。自古以来发菜、葛仙米、地木耳就是中华民族的天然传统食品，其中发菜因其丰富的营养和吉祥的发音(与“发财”谐音)长期受到消费者的青睐，在许多古籍中都有详细记载。发菜又名头发菜、地毛，学名发状念珠藻，是世界性分布的可食用陆生蓝藻，在我国西部和西北部的荒漠半荒漠地区经常可以见到，其食用和药用历史可以追溯到三千年前，近几十年来对其形态学、生态学、生理学以及发育生物学等方面已经有了一定的研究。发菜具有食疗、保健、滋补等功能，一直远销海内外，目前的资源开发所带来的环境恶化与草场保护等的矛盾日益尖锐，有研究称采掘1公斤发菜可以毁掉3公顷草原，可见过度的采掘产生的生态环境破坏和自然资源萎缩衰退状况是极其严重的。巨大的市场需求与有限的资源量间存在着难以调和的矛盾，解决的唯一出路是开展发菜的人工培养和集约化养殖生产。由于发菜生长分布于荒漠半荒漠和草原地带，生活环境具有一定的特异性，其生长所需要的条件如温度、水分、光照、光暗周期、营养等要求严格，目前难以人工培养出成熟的发菜丝状体，即使是发菜细胞，至今也没有连续培养成功的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供，以期在丝状体难以人工培养得到的情况下获得具有基本发菜营养成分的人工培养物，该方法简单易行，操作方便，培养物具备发菜的营养成分，可以制作各类保健饮品，缓解发菜市场需求的问题。为了达到上述目的，本专利技术采取了以下技术措施1、培养首先考虑的是培养液的配方，本专利技术从8个适合蓝藻生长的培养液中比较筛选出最适宜发菜细胞培养的培养液配方是HGZ培养液，NaNO3490-500mg/L，K2HPO435-40mg/L，MgSO4·7H2O 70-75mg/L，CaCl2·2H2O 35-36mg/L，Na2SiO4·9H2O 55-60mg/L，PIV 3ml/L，土壤浸出液3ml/L。以下是其它7个培养液的配方1#培养液Ca(NO3)20.2g/L，K2HPO40.075g/L，MgSO4·7H2O 0.1g/L，Na2CO30.2g/L，0.5％Na2MoO44ml，0.5％HBO34ml，1％FeC6H5O7·5H2O 0.5ml，1％C6H8O7·H2O0.5ml/L；2#培养液CuSO4·5H5O 19.6mg/L，ZnSO4·7H2O 44.0mg/L，CoCl2·6H2O 20.0mg/L，MnCl2·4H2O 36.0mg/L，Na2MoO4·2H2O 12.6mg/L，H3BO3618.4mg/L；3#培养液1#∶2#＝1∶1000；4#培养液MgSO4·7H2O 0.2g/L，K2HPO40.5g/L，NaCl 0.2g/L，CaSO4·2H2O 0.1g/L，FeCl3·6H2O 0.005g/L，CaCO31.0g/L；5#培养液MgSO4·7H2O 125mg/L，KNO3250mg/L，CaCl227mg/L，NaOH 3.76mg/L，FeSO4·7H2O 1.0mg/L，A51.0ml；6#培养液Ca(NO3)4·4H2O 0.04g/L，K2HPO40.01g/L，MgSO4·7H2O 0.025g/L，Na2CO30.02g/L，Na2SiO3·9H2O 0.025g/L，FeC6H5O70.003g/L，C6H8O7·H2O 0.003g/L；7#培养液MgSO4·7H2O 0.125g/L，Na2HPO40.075g/L，CaCO30.1g/L，1％FeC6H5O7·5H2O 0.5ml/L，1％C6H8O7·H2O 0.5ml/L Na2MoO4·2H2O0.5ml/L，A51ml/L，B61ml/L。2、培养液营养盐在藻种制备阶段使用分析纯级，溶解在无菌蒸馏水中；扩大培养和生产培养可使用化学纯，溶解在经净化过滤处理的自来水中即可。配制时营养盐严格按照顺序加入，杜绝沉淀的产生，然后将配制好的培养液进行灭菌。3、藻种制备A、原种，野外采集发菜丝状体，经消毒清洗后制备匀浆液；B、藻丝体或藻细胞的纯化培养，使用多级分纯的方法进行纯化，直到没有杂菌和杂藻为止(可以显微镜镜检观察)。C、扩大制种，将分纯的藻种接种到无菌培养液，在玻璃容器中通气培养，制备藻种。4、藻细胞培养，在进行通气规模化培养发菜细胞时，适宜的方式是逐级培养，原因是一次培养的细胞生命周期是12-14d左右，由微小的匀浆液培养在10多天内不可能达到理想的效果，需要不断地更换培养液(由少到多)和容器(由小到大)，逐渐增加培养细胞的浓度，得到高浓度的藻液；培养条件是温度24～26℃，光照40～50μmol.m-2s-1，光暗周期12h∶12h，气体流量5L/分钟通气培养。5、培养过程的实时监控，建立监控条件和监控标准是温度24-26℃，光照40～50μmol.m-2s-1，光暗周期12h∶12h，pH8.0-8.5；根据藻体生长的最佳参数适时调整培养条件。需要的设备有温度计、照度计、分光光度计、pH计、显微镜、计算机以及常规的实验室设备和技术支持。定期进行科学合理的监测，所有参数收集到计算机中建立数据库，用于分析藻细胞的生长情况；6、收获，在藻液浓度达到OD750nm值在0.5-1.0的时候，使用200目的筛绢网进行采收；7、干燥，藻泥在45℃以下晒干、风干或烘干均可；8、收获时在培养液中留一定浓度的藻液作藻种，更换一定体积的培养液，可以进行连续培养。本专利技术具有以下优点和效果设备简单，操作方便，清洁无污染，安全性好，营养丰富；同时与其他发菜专利技术相比，该技术所得到的产品并非人造发菜或发菜替代品，而是真正意义上具有发菜营养和口味的发菜制品。使用该技术生产发菜细胞可以吸收空气中的二氧化碳并固定氮气，向大气中释放氧气，有净化空气的作用，不产生有毒有害物质，培养液盐度低，生产周期短，14天左右就可以完成对数生长，效率高，广泛适用于城乡规模化培养。具体实施例方式2、藻细胞匀浆的制备首先将野生发菜丝状体使用95％乙醇溶液浸泡0.5-1.0min，再用蒸馏水洗涤3-4次，在灭菌的培养液中洗涤2-3次，再使用灭菌的培养液浸泡8-10h；其次是用玻璃匀浆器加入少量的石英砂，将丝状体破碎匀浆，匀浆液用于细胞培养；3、藻种无菌纯化，匀浆液接种到无菌培养液中，置于24～26℃的光照培养箱静置培养，培养40d后，在无菌室内显微镜下挑出单根藻丝体或单细胞，用无菌培养液洗涤4-5次，进行静置再培养，重复该操作5-8次，得到该藻的无菌藻种，将分纯的藻种接种到无菌培养液，在玻璃容器本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种培养发菜细胞的方法，包括下列步骤： Ａ、培养液配制，将配制好的贮藏液加入水中的顺序是，硝酸钠４９０－５００ｍｇ／Ｌ、磷酸氢二钾３５－４０ｍｇ／Ｌ、七水硫酸镁７０－７５ｍｇ／Ｌ、二水氯化钙３５－３６ｍｇ／Ｌ、九水硅酸钠５５－６０ｍｇ／Ｌ、微量金属元素ＰＩＶ３ｍｌ／Ｌ、土壤浸出液３ｍｌ／Ｌ，配制好的培养液用１１８－１２２℃高温干热灭菌，６０－９０分钟冷却后使用； Ｂ、藻细胞匀浆的制备，首先将发菜丝状体用９５％乙醇溶液浸泡０．５－１．０ｍｉｎ，再用蒸馏水洗涤３－４次，在灭菌的培养液中洗涤２－３次，再使用灭菌的培养液浸泡８－１０小时，将丝状体放在玻璃匀浆器中，加入石英砂，研磨成浆状物质； Ｃ、藻种无菌纯化，匀浆液接种到无菌培养液中，置于２４～２６℃的光照培养箱静置培养，培养４０ｄ后，在无菌室内显微镜下挑出单根藻丝体或单细胞，用无菌培养液洗涤４－５次，进行静置再培养，重复该操作５－８次，得到该藻的无菌藻种，将分纯的藻种接种到无菌培养液，在玻璃容器中通以过滤空气进行培养，制备得到该藻的扩大培养用藻种； Ｄ、藻细胞培养，培养条件是温度２４～２６℃，光照４０～５０μｍｏｌ．ｍ↑［－２］ｓ↑［－１］，光暗周期１２ｈ∶１２ｈ，气体流量５Ｌ／分钟左右通气培养； Ｅ、实时监控，监控条件和标准是：温度２４－２６℃，光照４０～５０μｍｏｌ．ｍ↑［－２］ｓ↑［－１］，光暗周期１２ｈ∶１２ｈ，ｐＨ８．０－８．５； Ｆ、收获，在藻液浓度达到ＯＤ↓［７５０ｎｍ］值在０．５－１．０的时候采收，使用２００目的筛绢网进行采收； Ｇ、干燥，藻泥在４５℃以下晒干、风干或烘干； Ｈ、继续培养，在收集藻泥后的培养容器保留藻液，更换培养液，进行继续培养。...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】

【专利技术属性】
技术研发人员：毕永红，胡征宇，徐敏，韩丹翔，邓中洋，罗玮，赵先富，陈珊，梅洪，
申请(专利权)人：中国科学院水生生物研究所，
类型：发明
国别省市：83[中国|武汉]