硒代木瓜蛋白酶的制备方法技术

本发明专利技术的硒代木瓜蛋白酶的制备方法属于生物化学领域，特别涉及制备具有高谷胱甘肽过氧化物酶活性的人工酶的方法。以木瓜蛋白酶、硒氢化钠为原料，工艺步骤分为硒化和后处理两步。所说的硒化，是用磷酸盐缓冲液溶解木瓜蛋白酶，再加入过量的硒氢化钠，氮气保护下进行硒化；所说的后处理，是硒化后冻干，干粉用磷酸盐缓冲液溶解，离心除硒后，经除盐，收集蛋白峰，冻干得硒代木瓜蛋白酶。硒化前可以进行活化处理。本发明专利技术具有如下特点：制备方法简单、步骤少；原料稳定、易得、成本低、分离提纯简单方便；制得的产物稳定性好，具有优良的抗氧化性，谷胱甘肽过氧化物酶活力高，适用于工业生产，具有药用潜力及工业应用价值。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物化学领域，特别涉及制备具有高谷胱甘肽过氧化物酶活性的人工酶的方法。
技术介绍
谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)是生物体内重要的含硒酶。由于它具有优良的抗氧化性，对治疗和预防克山病、心血管病、炎症及癌症等具有很大潜力。但由于该酶不稳定、来源有限，大分子量会引起人体免疫反应等缺点，极大限制了此酶医药学方面的开发及应用，因此，对此酶的模拟越来越受到重视。跟本专利技术最相接近的技术是，Hilvert小组做的硒化枯草杆菌蛋白酶，该硒化枯草杆菌蛋白酶是具有GPx活力的半合成的含硒酶。制备方法是以枯草杆菌蛋白酶、对甲苯基磺酰氟(PMSF)、硒氢化钠(NaHSe)为原料，经活化-硒化-后处理过程制得硒化枯草杆菌蛋白酶。具体的是，将5.5μmol、150mg的枯草杆菌蛋白酶溶于50mM哌嗪(PIPES)与10mM氯化钙(CaCl2)的4.5mL溶液中，使之保持PH值为7.0，加入含150μL、20mg/mL对甲苯基磺酰氟(PMSF)的乙腈溶液，在25℃温度下反应1小时，得到的磺化酶由凝胶过滤柱葡聚糖G-25分离，用50mM PIPES和10mM CaCl2PH值7.0洗脱；蛋白峰溶于10mL，与等体积1M的NaHSe溶液混合，在惰性气体保护下40℃保温36小时；得到的蛋白由Sephadex G-25分离。
技术介绍
的工艺仍不够简单，所制得的硒化枯草杆菌蛋白酶的GPx活力远低于天然酶。
技术实现思路
我们选用半胱氨酸蛋白酶家族中的代表-木瓜蛋白酶(Papain)作为蛋白骨架来制备GPx模拟物。达到制备工艺简单，制备出稳定性和水溶性好、活力高的GPx模拟物的目的。木瓜蛋白酶的晶体结构、酶学性质、作用机制都已有较详尽的研究。它由分子量为23350的一条肽链组成。活性部位的25位半胱氨酸和158位组氨酸对催化至关重要。它的底物专一性较差，主要有蛋白水解酶和脂酶活性等，本身不具有过氧化物酶活性。本专利技术的原理是利用木瓜蛋白酶活性部位催化机制与GPx的相似性及其底物结合部位对GSH的亲合力，对木瓜蛋白酶底物结合部位进行化学修饰，引入GPx的活性氨基酸—硒代半胱氨酸，从而使其具有高GPx活力。本专利技术的硒代木瓜蛋白酶的合成是以木瓜蛋白酶和硒氢化钠(NaHSe)为原料，工艺步骤分为硒化和后处理两步。所说的硒化，是用磷酸盐缓冲液(PBS)溶解木瓜蛋白酶，再加入过量的硒氢化钠，氮气保护下硒化15～55小时。硒化的温度范围为20℃-45℃。所说的后处理，是硒化后取出冻干，干粉用磷酸盐缓冲液溶解，离心除硒后，经除盐，收集蛋白峰，冻干，即得硒代木瓜蛋白酶。上述的磷酸盐缓冲液(PBS)的浓度范围是10～100mM(mmol/L)、PH值5.0～9.0。控制硒化温度和时间是必要的，温度低于20℃，时间低于15小时，硒化效果不好，高于45℃，高于55小时，都能使酶变性严重，收率太低。当用50mM pH7.0PBS溶解酶，35-40℃硒化36-40小时时，硒化效果更好。为了得到含硒量不同，其GPx活力也不同的产品，可以在硒化之前，先进行活化处理。即用磷酸盐缓冲液(PBS)溶解木瓜蛋白酶，加入对甲苯基磺酰氟(PMSF)的乙腈溶液，对木瓜蛋白酶进行活化。PMSF分两次加入，两次之间间隔10～40分钟。PMSF的用量可从0到酶摩尔数的100倍不等。在15～40℃温度下活化1～4小时。当PMSF的用量为0时，即表示不经过活化处理过程。本专利技术具有如下特点1.木瓜蛋白酶作为原料稳定、易得、成本低、分离提纯简单方便，适用于工业生产。2.硒代木瓜蛋白酶制备方法简单、步骤少，可扩大生产。3.硒代木瓜蛋白酶模型的GPx活力高于已有文献报道的大分子GPx模拟物，且高于天然兔肝GPx数倍。4.硒代木瓜蛋白酶稳定性好，具有优良的抗氧化性，具有药用潜力及工业应用价值，如化妆品工业等。附图说明图1是硒代木瓜蛋白酶对线粒体膨胀度的影响具体实施方式实施例1硒氢化钠的制备将81mg NaBH4溶解于装有1mL水的小瓶中，再将79mg硒粉缓慢加到NaBH4的溶液，此刻看到水中有大量气体冒出，在室温下反应5分钟。然后盖上一插入针头的胶盖，直到反应没有气体溢出，取下针头，密封，用时用针吸出。反应方程式为由于NaBH4与H+反应，有少量H2Se气体产生。为防止中毒，反应在通风橱中进行。实施例2硒代木瓜蛋白酶的制备木瓜蛋白酶(2mg)溶于2mL 50mM PBS，pH7.0，用注射器加入实施例1制备的200μL 1M的NaHSe溶液，氮气保护下40℃保温36小时，然后取出冻干，干粉用10mM PBS(pH7.0)溶解，离心除硒后，经Sephadex G-25除盐，收集蛋白峰，冻干，即得硒代木瓜蛋白酶。得到的硒代木瓜蛋白酶比活可达44770.3U/μmol。实施例3硒代木瓜蛋白酶的制备(经活化再硒化)木瓜蛋白酶(2mg)溶于2mL 50mM PBS，pH7.0，50μL PMSF(20mg/mL乙腈溶液)分两次隔30分钟加入上述缓冲液，室温保温3小时，然后通高纯氮约20分钟以排除氧气。用注射器加入实施例1制备的200μL 1M的NaHSe溶液，氮气保护下30℃保温36小时。此后的后处理过程同实施例2。得到的硒代木瓜蛋白酶比活可达54018.7U/μmol。实施例4硒代木瓜蛋白酶的GPX活力根据Wilson方法测量了硒化前和硒化后酶的GPX活力。反应在37℃，反应体系为500μL，含50mM PBS，pH7.0、1mM EDTA、1mMNaN3、1mM GSH、1U GSH还原酶和10-50nM酶。反应预保温7分钟，加0.25mM NADPH再保温3分钟，然后加入0.5mM氢过氧化物启动反应。在340nm处监测NADPH被氧化时吸光度值的降低。以缓冲液代替人工酶为空白以消除非酶促反应。GPX活力单位定义为37℃每分钟每消耗1微摩尔NADPH所需的人工酶的量。酶活力表示为每摩尔酶模拟物的活力单位数(U/μmol)。硒代枯草杆菌蛋白酶对芳香巯基化合物具有特异亲和性，因而对于芳香巯基化合物表现出较高的催化活性，而对GPX天然底物GSH只表现出很低的活性。而硒代木瓜蛋白酶的GPx活力远高于硒化枯草杆菌蛋白酶，从表一中可以看出它甚至比天然兔肝GPx活力还高好几倍。表一酶 底物 比活(U/μmol)木瓜蛋白酶 H2O20硒代木瓜蛋白酶 H2O254018.7天然兔肝GPx H2O25780实施例5硒代木瓜蛋白酶的生物学效应主要测定GPX模拟物对心肌线粒体抗氧化损伤的保护作用。从新鲜牛心中提取线粒体，线粒体浓度用考马斯亮兰法确定，标准蛋白为牛血清白蛋白。在pH7.4的磷酸钾缓冲液中，含有0.125M KCl、1mM MgCl2、5mM谷氨酸盐、线粒体(0.5mg/ml)、1μM GSH及GPX模拟物，于37℃保温。加入终浓度为0.5mM Vc和12.5μM FeSO4后开始振荡，并记时，分别于不同时间取出测膨胀度。不含模拟物的为损伤组，相同条件下只含线粒体不含模拟物、Vc和FeSO4的作为空白对照组。线粒体膜受损伤后其形态发生变化，于520nm波长测其浑浊度变化。横坐标为时间，纵坐标为光密度。光密度下降表示线粒体膨胀度增加。图1中(■▲●)分别表示空白对照组、损伤组、含硒代木瓜蛋白酶的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种硒代木瓜蛋白酶的制备方法，是以硒氢化钠为原料，工艺步骤为硒化和后处理两步；其特征在于，原料还有木瓜蛋白酶；所说的硒化，是用磷酸盐缓冲液溶解木瓜蛋白酶，再加入过量的硒氢化钠，氮气保护下硒化１５～５５小时，硒化的温度范围为２０℃－４５℃；所说的后处理，是硒化后取出冻干，干粉用磷酸盐缓冲液溶解，离心除硒后，经除盐，收集蛋白峰，冻干，得硒代木瓜蛋白酶。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：俞慧君，罗贵民，刘俊秋，任晓君，沈家骢，
申请(专利权)人：吉林大学，
类型：发明
国别省市：82[中国|长春]