一种植物双元杂交表达载体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种植物双元杂交表达载体及其应用。该植物双元杂交表达载体，由启动子载体和功能基因表达载体组成；所述启动子载体包括目的启动子与转录激活因子编码基因的融合序列；所述功能基因表达载体包括所述目的基因与所述转录激活因子的调控元件的融合序列。本发明专利技术还提供了利用该植物双元杂交表达载体进行植物转基因杂交育种的方法。该植物双元杂交表达载体还可用于筛选启动子和鉴定目的基因功能。本发明专利技术可用于定向改造和设计植物的性状，可缩短植物杂交育种和改良品种的周期，保证了杂交良种的纯度。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及植物基因工程领域中一种植物双元杂交表达载体及其应用，特别涉及一种植物双元杂交表达载体，利用该植物双元杂交表达载体进行植物转基因杂交育种的方法和该植物双元杂交表达载体在筛选启动子和鉴定目的基因功能中的应用。
技术介绍
在酵母、昆虫、植物以及哺乳动物等生物中，均存在一类转录激活因子(transcriptional activator)，能够激活基因的转录。这类激活因子的结构都基本相似，由一个DNA结合区(结构域)(DNA-binding domain，DBD)和一个转录激活区(结构域)(transcriptional activation domain，AD)组成，可以同转录组分的操纵子结合并激活转录反应。其中酵母蛋白Gal4(Allen，L.& Raymond F.(1984).Primary structure of the Saccharomyces cerevisiae Gal4 gene.Molecular andCellular Biology 4，260-267；Johnston，M.(1987).A model fungal generegulation mechanismthe Gal4 genes of Saccharomyces Cerevisiae.Microbiol.Rev.1987，51，458-476)就是一个典型的转录激活因子，它由881个氨基酸组成，N端1-147位氨基酸含细胞核定位序列和与酵母启动子上游激活序列结合的结构域，它与酵母细胞启动子上游激活区序列结合；C端768-881位氨基酸含转录激活结构域，可激活起始转录。为增强转录激活因子激活转录的能力，常在DNA结合区加入一段负电荷蛋白(Giniger，E.，Varnum，S.M.& Ptashne M.(1985).SpecificDNA binding of Gal4，appositive regulatory protein of yeast.Cell 40，767-774)。按照Ivan Sadowski(1988)的方法，可将从庖疹病毒中克隆的高酸性蛋白VP16(Dalrymple，M.A.，McGeoch，D.J.，Davison，A.J.& Preston C.M.，DNA sequenceof the herpes simplex virus type I gene whose product is responsible fortranscriptional activation of immediate early promoters.Nucleic AcidsResearch，1984，13(21)，7865-7879)的基因与Gal4的DNA特异结合区(Gal4 DBD)构建成融合基因。在疱疹病毒中，VP16通过其末端氨基酸序列结合宿主编码蛋白，该蛋白可以识别启动子DNA序列，从而快速激活转录病毒早期表达基因(Triezenberg，S.J.，LaMarco，KL.& McKnight，SL.，(1988).Evidence of DNAproteininteractions that mediate HSV-1 immediate early gene activation by VP16.GenesDevelopment.2，730-742；Preston，CM.，Frame，MC.& Campbell，M.E.M.，(1988).A complex formed between cell components and an HSV structural polypeptidebinds to a viral immediate early gene regulatory DNA sequence.Cell 52，425-434)。研究表明，Gal4(DBD)-VPl6融合蛋白可以高效地激活目的基因的转录(Sadowski，I.，Ma，J.，Triezenberg，S.，Ptashne，M.，(1988).GAL4-VP16 isan unusually potent transcriptional actibator.Nature.335，563-4)。多年来人们对这类转录因子做了大量深入的研究，并广泛应用到酵母、昆虫、动物细胞(Fischer，JA.，iniger，E.，Maniatis，T.& Ptashne，M.(1988).GAL4 activatestranscription in Drosophila.Nature 332，853-856；Sadowski，I.，Ma，J.，Triezenberg，S.，Ptashne，M.，(1988).GAL4-VP16 is an unusually potenttranscriptional actibator.Nature.335，563-564)以及植物体系(Wilde RJ.CookeSE，Brammar WJ.，et al，(1994).Control of gene expression in plant cells usinga VP16 chimeric protein.Plant Molecular Biology 24，381-388；Guyer，D.，Tuttle，A.，Rouse，S.，Volrath，S.，Johnson，M.，Potter，S.，Gorlach，J.，Goff，S.，Crossland，L.and Ward，E.，(1998).Actibation of Latent Transgenesin Arabidopsis Using a Hybrid Transcription Factor.Genetics，149，633-639)的研究中。利用转录激活因子的特点，人们建立了各种双元杂交表达系统，比如现在广泛应用的酵母双杂交系统、动物细胞培养系统中的双元表达体系等，能够有效地在转录水平调节基因表达，研究目标基因的特性和功能。在以往的研究中，人们更注重于将双元表达系统用于理论研究，常常利用转录激活因子双元杂交系统调控基因的特异性表达或表达水平，从而更容易地研究目的基因尤其是致死基因在生物体中的功能。酵母HAP1(Heme Activator Protein 1)是另一个Gal4转录因子家族的成员，它有保守的Zn2Cys6集团。HAP1能够结合许多基因的UASs(upstream activationsequences)区，并激活这些基因的转录。利用HAP1的DNA结合区和VP16构建融合蛋白(HAP1-VP16)同样也能提高它在植物中表达效率和与UAS的结合能力(Hach A，HonT，Zhang L.The coiled coil dimerization element of the yeast transcriptionalactivator Hap1，a Gal4 family member，is dispensable for DNA binding butdif本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种植物双元杂交表达载体，由启动子载体和功能基因表达载体组成；所述启动子载体包括目的启动子与转录激活因子编码基因的融合序列；所述功能基因表达载体包括所述目的基因与所述转录激活因子的调控元件的融合序列。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：邓兴旺，薛永彪，王喜萍，夏勉，苏宁，
申请(专利权)人：北京未名凯拓农业生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]