一种复杂组织器官前体的制备方法技术

一种复杂组织器官前体的制备方法，属于生物组织工程技术领域。本发明专利技术利用种子细胞或基因与基质材料制备成微胶珠或多管道三维结构，并利用计算机辅助快速成型法、涂覆法、一次性灌注成形等技术实现细胞和支架材料在空间的准确定位，克服了组织工程目前存在的在三维支架中诱导培养细胞需要时间长、细胞在支架中分布不均匀、细胞很难渗入到深层结构中等缺点。利用零部件组合的原理可以达到复杂器官中不同部位不同细胞类型及结构类型的要求，实现复杂组织器官的重建，从而达到修复再生的目的。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及，属于生物组织工程

技术介绍
世界上每年患有组织缺损或器官衰竭的病人数逾千万，仅美国每年以外科手术治疗此类病人约800万。然而，活体供体器官有限，现有的机械装置不具备器官的所以功能，不能防止患者的病情进一步恶化。据此，以提高此类疾患治疗水平为宗旨的组织工程(TissueEngineering)技术应运而生。组织工程是一门由生物学、医学、材料学、工程学等多学科交叉产生的高新技术学科。其含义是应用生命科学与工程学的原理与技术，在正确认识哺乳动物的正常及病理两种状态下的组织结构与功能关系的基础上，研究、开发用于修复、维护、促进人体各种组织或器官损伤后的功能和形态的生物替代物。近十年来，科学家们运用组织工程技术，利用人体残余器官的少量正常细胞进行体外繁殖，获得患者所需的、具有相同功能的器官，又不存在排斥反应，已取可喜的成果，不少新近成立的生物技术公司正准备正在投入巨资实现商品化。在美国，已形成价值40亿美元的产业，并以每年25％的速度递增。如Pro Osteon珊瑚骨移植材料产值超过1000万美元。但现存的组织工程技术面临许多困难和限制，组织工程应用研究所取得的成功均是在那些结构与生理功能较为简单的组织器官如骨骼、软骨、皮肤。传统的支架制备技术不能准确地控制孔的大小、结构、空间分布及贯通的通道，营养供应和血管长入都受到很大的限制。传统组织工程方法一般先制备结构支架，在进行细胞培养过程中由于上层细胞消耗大部分的氧气和营养，限制了这些组分向底层扩散，从而限制了细胞向支架深层的迁移等。这种先制备支架，再培养细胞的方法，耗时又费力，细胞在向支架内迁移的过程中很可能就已经变型、老化，达不到及时治疗临床病人的要求。同时传统的组织工程技术不能满足将不同的细胞在空间准确定位与定点放置，构建复杂组织器官的功能梯度结构的需求。本专利技术在综合前人工作的基础上，利用各种先进技术，实现细胞和支架材料在空间的准确定位，利用零部件组合的原理实现复杂组织器官的重建，从而达到修复再生的目的，具有广泛的应用前景。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供，旨在前人工作的基础上，利用计算机辅助的快速成型技术、涂覆法或一次性灌注成形技术，实现细胞和支架材料在空间的准确定位，利用零部件组合的原理实现复杂组织器官的重建，从而达到修复再生的目的本专利技术的技术方案如下，其特征在于该方法包括如下步骤 1)种子细胞或基因与基质材料微胶珠的制备a.分离或诱导所需的种子细胞或基因，将所得的不同种类的种子细胞或基因的悬浮液离心分离后分别与含有1～40％的基质材料的溶液均匀混合，制成细胞或基因与基质材料的混合物；所述的基质材料为明胶、胶原、明胶/胶原、明胶/壳聚糖或明胶/海藻酸钠，其中所述的明胶/壳聚糖或明胶/海藻酸钠的混合溶液中明胶与壳聚糖或明胶与海藻酸钠的质量比0.5～100∶1，所述种子细胞或基因占所述基质材料混合溶液的0.01～10％；所述的基质材料的溶液为水溶液或pH＝6～8的0.09M的氯化钠或0.09M的氯化钠和3-羟甲基氨基甲烷盐酸溶液；b.用静电微囊发生器或微滴注入技术将细胞或基因与明胶/壳聚糖基质材料喷入1～20％三磷酸钠水溶液交联；对于明胶/海藻酸钠基质材料喷或注入浓度为1～20％乳酸钙或氯化钙水溶液交联，形成微球；然后将三磷酸钠水溶液或乳酸钙、氯化钙水溶液吸出；将微球与浓度为0.1～1％的戊二醛溶液进一步反应1～180秒钟，形成微胶珠；对于细胞或基因与明胶、胶原或明胶/胶原混合物直接喷或注入浓度为0.1～1％的戊二醛溶液反应1～180秒钟，形成微胶珠；对于细胞或基因与明胶/壳聚糖、明胶/海藻酸钠基质材料形成的微胶珠再与浓度为0.1～10％柠檬酸钠缓冲溶液反应10分钟～2小时，形成液化微胶珠；2)制备网管状结构将生物可降解高分子材料或其与肝素的复合物溶液，利用计算机辅助的快速成型技术、涂覆法或一次性灌注成形技术，经冷冻干燥，制成网管状组织器官不同零件的三维结构支架；所述的生物可降解高分子材料为聚氨酯、聚乳酸、乳酸与乙醇酸共聚物、聚羟基酸、3-羟基丁酸和3-羟基己酸共聚物、聚己内酯、胶原、明胶、纤维蛋白、纤维粘连蛋白、胶原/壳聚糖、胶原/硫酸软骨素、明胶/壳聚糖或其中两种复合物，其中聚氨酯、聚乳酸、乳酸与乙醇酸共聚物、聚羟基酸、3-羟基丁酸和3-羟基己酸共聚物、聚己内酯采用浓度为1～10％的1，4-二氧六环溶液；其中胶原、明胶、纤维蛋白、纤维粘连蛋白、胶原/壳聚糖、胶原/硫酸软骨素、明胶/壳聚糖或其中两种复合物采用浓度为1～40％的的水溶液或pH＝6～8的0.09M的氯化钠或0.09M的氯化钠和3-羟甲基氨基甲烷盐酸溶液，成形后用浓度为0.1～1％的交联剂戊二醛或浓度1～10％的三磷酸钠平衡溶液交联；3)组装利用微囊注射技术将步骤1)b中的微胶珠注射到所述的三维结构支架相应的位置上，体外培养或进行体内植入；上述步骤1)a中所述的细胞或基因与基质材料的混合物利用凝胶注射技术直接注射到步骤2)中的三维结构支架中，再用浓度为0.1～1％的戊二醛溶液、1～20％乳酸钙、氯化钙或三磷酸钠水溶液交联。所述的基质材料中复合有细胞生长因子。本专利技术提供的另，其特征在于该方法包括如下步骤1)种子细胞或基因与基质材料管道状三维结构的制备a.分离或诱导所需的种子细胞或基因，将所得的不同种类的种子细胞或基因的悬浮液离心分离后分别与含有1～40％的基质材料的溶液均匀混合，制成细胞或基因与基质材料的混合物；所述的基质材料为明胶、胶原、明胶/胶原、明胶/壳聚糖或明胶/海藻酸钠，其中所述的明胶/壳聚糖或明胶/海藻酸钠的混合溶液中明胶与壳聚糖或明胶与海藻酸钠的质量比0.5～100∶1，所述种子细胞或基因占所述基质材料混合溶液的0.01～10％；所述的基质材料的溶液为水溶液或pH＝6～8的0.09M的氯化钠或0.09M的氯化钠和3-羟甲基氨基甲烷盐酸溶液；b.在0～30℃的环境下根据预先设计的结构和定义规划的路径，将上述细胞与基质材料的混合物通过微滴喷射、数字挤压技术利用细胞组装机在成形室中逐层堆积得到细胞与基质材料的多管道三维立体结构；对于基质材料为明胶/壳聚糖形成的管道状三维结构，用1～20％三磷酸钠水溶液交联；对于基质材料为明胶/海藻酸钠形成的管道状三维结构，用浓度为1～20％乳酸钙或氯化钙水溶液交联；然后将交联剂吸出，再与浓度为0.1～1％的戊二醛水或生理盐水溶液反应1～180秒钟；对于基质材料为明胶/壳聚糖、明胶/海藻酸钠基质材料形成的管道状三维结构再与浓度为0.1～10％柠檬酸钠缓冲溶液反应10分钟～2小时，形成内部液化的管道状三维结构；对于基质材料为明胶、胶原或明胶/胶原形成的管道状三维结构，直接用浓度为0.1～1％的戊二醛溶液交联1～180秒钟；2)制备网管状结构将生物可降解高分子材料或其与肝素的复合物溶液，利用计算机辅助的快速成型技术、涂覆法或一次性灌注成形技术，经冷冻干燥，制成网管状组织器官不同零件的三维结构支架；所述的生物可降解高分子材料为聚氨酯、聚乳酸、乳酸与乙醇酸共聚物、聚羟基酸、3-羟基丁酸和3-羟基己酸共聚物、聚己内酯、胶原、明胶、纤维蛋白、纤维粘连蛋白、胶原/壳聚糖、胶原/硫酸软骨素、明胶/壳聚糖或其中两种复合物，其中聚氨酯、聚乳本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种复杂组织器官前体的制备方法，其特征在于该方法包括如下步骤：１）种子细胞或基因与基质材料微胶珠的制备ａ．分离或诱导所需的种子细胞或基因，将所得的不同种类的种子细胞或基因的悬浮液离心分离后分别与含有１～４０％的基质材料的溶液 均匀混合，制成细胞或基因与基质材料的混合物；所述的基质材料为明胶、胶原、明胶／胶原、明胶／壳聚糖或明胶／海藻酸钠，其中所述的明胶／壳聚糖或明胶／海藻酸钠的混合溶液中明胶与壳聚糖或明胶与海藻酸钠的质量比０．５～１００∶１，所述种子细胞或基因占所述基质材料混合溶液的０．０１～１０％；所述的基质材料的溶液为水溶液或ｐＨ＝６～８的０．０９Ｍ的氯化钠或０．０９Ｍ的氯化钠和３－羟甲基氨基甲烷盐酸溶液；ｂ．用静电微囊发生器或微滴注入技术将细胞或基因与明胶／壳聚糖基质材料喷入１～２０ ％三磷酸钠水溶液交联；对于明胶／海藻酸钠基质材料喷或注入浓度为１～２０％乳酸钙或氯化钙水溶液交联，形成微球；然后将三磷酸钠水溶液或乳酸钙、氯化钙水溶液吸出；将微球与浓度为０．１～１％的戊二醛溶液进一步反应１～１８０秒钟，形成微胶珠；对于细胞或基因与明胶、胶原或明胶／胶原混合物直接喷或注入浓度为０．１～１％的戊二醛溶液反应１～１８０秒钟，形成微胶珠；对于细胞或基因与明胶／壳聚糖、明胶／海藻酸钠基质材料形成的微胶珠再与浓度为０．１～１０％柠檬酸钠缓冲溶液反应１０分钟～２小时，形成液化微胶珠；２）制备网管状结构：将生物可降解高分子材料或其与肝素的复合物溶液，利用计算机辅助的快速成型技术、涂覆法或一次性灌注成形技术，经冷冻干燥，制成网管状组织器官不同零件的三维结构支架；所述的生物可降解高分子材料为聚氨酯、聚乳酸 、乳酸与乙醇酸共聚物、聚羟基酸、３－羟基丁酸和３－羟基己酸共聚物、聚己内酯、胶原、明胶、纤维蛋白、纤维粘连蛋白、胶原／壳聚糖、胶原／硫酸软骨素、明胶／壳聚糖或其中两种复合物，其中聚氨酯、聚乳酸、乳酸与乙醇酸共聚物、聚羟基酸、３－羟基丁酸和３－羟基己酸共聚物、聚己内酯采用浓度为１～１０％的１，４－二氧六环或氯仿溶液；其中胶原、明胶、纤维蛋白、纤维粘连蛋白、胶原／壳聚糖、胶原／硫酸软骨素、明胶／壳聚糖或其中两种复合物采用浓度为１～４０％的的水溶液或ｐＨ＝６～８的０．０９Ｍ的氯化钠或０．０９Ｍ的氯化钠和３－羟甲基氨基甲烷盐酸溶液，成形后用浓度为０．１～１％的交联剂戊二醛或浓度１～１０％的三磷酸钠平衡溶液交...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：颜永年，王小红，熊卓，林峰，吴任东，张人佶，卢清萍，
申请(专利权)人：清华大学，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]