共表达PRRSV ORF5和PCV2 ORF2双价核酸疫苗的制备方法技术

本发明专利技术猪繁殖与综合症病毒和猪圆环病毒双价核酸疫苗的制备方法，简称共表达ＰＲＲＳＶ　ＯＲＦ５和ＰＣＶ２　ＯＲＦ２双价核酸疫苗的制备方法，本发明专利技术根据哺乳动物细胞真核表达载体ｐＩＲＥＳ　ＭＣＳＡ　ＭＣＳＢ多克隆位点的序列和ＰＲＲＳＶ　ＳＤ１株ＯＲＦ５和ＰＣＶ　ＳＤ１株的ＯＲＦ２基因阅读框架，同时考虑外源基因的表达量在基因起始密码子的前面加入Ｋｏｚａｋ序列，分别设计了针对ＯＲＦ５、ＯＲＦ２的引物Ｙ１／Ｙ２，Ｈ１／Ｈ２。将ＰＣＲ产物ＯＲＦ２经双酶切回收后插入真核表达载体ｐＩＲＥＳ得到ｐＩＲＥＳ－ＯＲＦ２，ＲＴ－ＰＣＲ产物ＯＲＦ５经双酶切回收后插入ｐＩＲＥＳ－ＯＲＦ２构建成重组质粒ｐＩＲＥＳ－ＯＲＦ２／ＯＲＦ５。经ＰＣＲ、ＲＴ－ＰＣＲ、双酶切及测序鉴定，证明成功构建了转移载体ｐＩＲＥＳ－ＯＲＦ２／ＯＲＦ５。

【技术实现步骤摘要】

【技术保护点】
共表达ＰＲＲＳＶ　ＯＲＦ５和ＰＣＶ２　ＯＲＦ２双价核酸疫苗的制备方法，其特征在于在哺乳动物真核表达载体的２个多克隆位点中分别插入了ＰＲＲＳＶ　ＯＲＦ５和ＰＣＶ２　ＯＲＦ２完整基因，该核酸疫苗可在哺乳动物细胞中同时表达ＰＲＲＳＶ　Ｇ Ｐ５蛋白和ＰＣＶ２　Ｃａｐ蛋白；　上述核酸疫苗通过以下方法构建而成：　１）ＯＲＦ２及ＯＲＦ５的扩增　扩增ＰＣＶ　ＯＲＦ２的引物为：　Ｈ１：５’－ＡＴＣＧＣＴＡＧＣＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＡＣＧＴＡＴＣＣＡＡ－３’ 　Ｎｈｅ　Ｉ　Ｈ２：５’－ＧＣＣＧＣＧＧＡＡＴＴＣＴＣＡＣＴＴＡＧＧＧＴＴＡＡＧＴ－３’　ＥｃｏＲ　Ｉ　预期扩增长度为７０２ｂｐ；加粗部分为Ｋｏｚａｋ序列　扩增ＰＲＲＳＶ　ＯＲＦ５的引物为：　Ｙ１：５’－Ａ ＡＴＣＴＡＧＡＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＴＴＧＧＡ－３’　Ｘｂａ　Ｉ　Ｙ２：５’－ＧＣＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＣＴＧＧＣＧＴＧＴＡＧ－３’　Ｎｏｔ　Ｉ　预期扩增长度为７０２ｂｐ；加粗部分为Ｋｏｚａｋ序列　在每条引物的５ ’端均含有限制性内切酶酶切位点，分别以ＰＲＲＳＶ　ＳＤ１株的ｃＤＮＡ和ＰＣＶ２ＳＤ１株的ＤＮＡ为模板，通过引物Ｙ１／Ｙ２扩增ＰＲＲＳＶ　ＯＲＦ２，通过Ｈ１／Ｈ２扩增ＰＣＶ２　ＯＲＦ２基因；以ＰＣＶ　ＳＤ１株的ＤＮＡ为模板，应用ＲＴ－ ＰＣＲ技术扩增ＯＲＦ２全基因，通过每对引物的限制性酶切位点，把ＯＲＦ５及ＯＲＦ２分别插入ｐＩＲＥＳ两个不同的多克隆位点中，产生ｐＩＲＥＳ－ＯＲＦ２／ＯＲＦ５重组质粒，该质粒经酶切及ＰＣＲ鉴定；　２）ｐＩＲＥＳ－ＯＲＦ２／ＯＲＦ５真核重 组表达载体的构建　将ＰＣＲ产物ＯＲＦ２经双酶切回收后插入真核表达载体ｐＩＲＥＳ得到ｐＩＲＥＳ－ＯＲＦ２，ＲＴ－ＰＣＲ产物ＯＲＦ５经双酶切回收后插入ｐＩＲＥＳ－ＯＲＦ２构建成重组质粒ｐＩＲＥＳ－ＯＲＦ２／ＯＲＦ５，经ＰＣＲ、ＲＴ－ＰＣＲ 、双酶切及测序鉴定，证明成功构建了转移载体ｐＩＲＥＳ－ＯＲＦ２／ＯＲＦ５；　３）ｐＩＲＥＳ－ＯＲＦ２／ＯＲＦ５真核重组质粒的转染　将构建成功的ｐＩＲＥＳ－ＯＲＦ２ＯＲＦ５重组质粒用脂质体法转染真核细胞Ｍａｒｃ－１４５，经Ｇ４１８ 加压筛选获得稳定表达的细胞株，以ＰＣＲ、ＲＴ－ＰＣＲ、和间接免疫荧光检测目的蛋白的表达情况，证明：经ＰＣＲ、ＲＴ－ＰＣＲ检测到...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王金宝，李俊，任慧英，吴家强，张秀美，周顺，温建新，赵鸿雁，
申请(专利权)人：山东省农业科学院畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：88[中国|济南]