利用甘草毛状根及其培养液制备甘草总黄酮的方法技术

本发明专利技术提供了甘草毛状根的培养方法以及利用甘草毛状根及其培养液制备甘草总黄酮的方法，其包括将甘草毛状根在不含吐温的液体培养基中培养至旺盛生长期，并将得到的旺盛生长期的甘草毛状根在含有吐温的液体培养基中培养５天以上。通过聚酰胺层析注用不同浓度的乙醇进行洗脱，对培养液中总黄酮进行分离，甘草总黄酮的转移率为９７．２３％，甘草查尔酮Ａ的转移率为９８．１４％，光甘草定的转移率为９７．５４％。本发明专利技术还提供了一种由上述制备方法得到的甘草总黄酮及其医药应用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，具体而言，本专利技术涉及甘草毛状根的培养方法以及利用甘草毛状根及其培养液制备甘草总黄酮的方法。另外，本专利技术还涉及一种由上述制备方法得到的甘草总黄酮及其医药应用。
技术介绍
甘草是我国重要的传统中药，具有清热解毒、润肺祛痰、缓急止痛、补气益脾胃、调和诸药等功效，被誉为“百草之王”。近年来人们发现甘草中含有的各种黄酮是除了甘草酸外的另一类活性物质，甘草总黄酮具有抗氧化、抗肿瘤、抗艾滋、抗炎、抗溃疡、抗衰老等药理作用，需求强劲，目前已应用到医药、食品、保健品以及化妆品等各个领域。随着甘草的不断开发利用，野生资源采挖过度，给自然环境和生态资源造成了巨大的破坏。2001年9月我国为了保护日益匮乏的甘草资源，限制了对野生甘草的采挖，并且禁止使用野生甘草及其产品作为保健食品成分，甘草供需矛盾更加突出。甘草资源的匮乏及其应用的限制成为限制甘草应用的瓶颈，迫切需要开发甘草活性成分的新来源、新途径。利用甘草毛状根生产甘草总黄酮是一条具有良好前景的有效途径，且有许多适应工业化生产的特点，如成本低，生长快，生产能力稳定等。但是甘草毛状根中的黄酮含量远低于生药根的含量，影响了甘草毛状根的进一步发展放大和工业化，如张荫麟等报道乌拉尔甘草毛状根的总黄酮含量为干重的0.39％，远低于生药根中的黄酮含量。目前对影响毛状根中黄酮含量的因素研究较多，如杨睿等报道了茉莉酸甲酯和水杨酸对水母雪莲毛状根中黄酮类化合物含量的影响，在毛状根接种后第10d添加浓度为0.02mmol/L的茉莉酸甲酯，黄酮类化合物比对照提高34.1％；在毛状根接种后第15d添加浓度为0.03mmol/L的水杨酸时，黄酮类化合物比对照提高52.9％。但是目前对于毛状根培养液中黄酮的含量、影响因素及如何利用研究的较少，尽管于树宏等报道了吐温-80对野葛毛状根中异黄酮(isoflavone)含量的影响，但是不涉及对甘草的研究，更不涉及对甘草毛状根及其培养液中黄酮(flavone)含量的研究和启示。另外，吐温作为常用的药用辅剂，在中药复方制剂中作为辅料可以与甘草或其提取物等活性成分配制在一起构成药物组合物，如中国专利95108283、02100222、和200610035831等，但是在这些药物中吐温仅仅是作为药用辅剂而存在的。为此，本专利技术人经过长期研究，令人意外地发现了，利用含吐温的液体培养基培养5天以上的长时间，能够显著提高甘草毛状根组织培养得到的毛状根及其培养液中黄酮类化合物的含量，尤其是能够促使总黄酮从甘草的毛状根释放到培养液中，大大提高培养液中活性成分的含量；另外，本专利技术人还发现利用简单的乙醇梯度洗脱聚酰胺层析柱，即可制备高纯度的甘草总黄酮。这样从毛状根及其培养液中获取甘草总黄酮，能够有效避免资源的浪费，更为令人意想不到的是，本专利技术的甘草总黄酮的诸如体外肿瘤-->杀伤等效果甚至优于现有文献报道的甘草总黄酮。
技术实现思路
本专利技术的目的在于，为解决甘草资源短缺与甘草需求的矛盾，以达到产业化生产甘草黄酮，替代甘草资源的目标，提供了利用组织培养的甘草毛状根及其培养液制备甘草总黄酮的方法，提高了其中甘草总黄酮的含量，并进一步提供了制备或提纯这些甘草总黄酮的方法。因此，本专利技术提供了甘草毛状根的培养方法、制备提高甘草总黄酮含量的甘草毛状根和/或提高甘草总黄酮含量的甘草毛状根培养液的应用、制备甘草总黄酮的方法以及由其制备得到的甘草总黄酮产品。具体而言，在第一方面，本专利技术提供了培养能提高甘草总黄酮含量的甘草毛状根和/或甘草毛状根培养液的方法，其包括：(1)将甘草毛状根在不含吐温的液体培养基中培养至旺盛生长期；(2)将步骤(1)得到的旺盛生长期的甘草毛状根在含有吐温的液体培养基中培养5天以上。甘草总黄酮(total flavonoids of Glycyrrhiza)是提取自甘草的富集了甘草中黄酮类化合物(即，黄酮类成分)的提取物，其具有抗氧化、抗肿瘤、抗艾滋、抗炎、抗溃疡、以及抗衰老等药理作用，常作为药物活性成分或活性成分之一而使用(参见：邢国秀等.甘草中黄酮类化学成分的研究进展.中国中药杂志，2003，28(7)：593)。甘草总黄酮可以提取自甘草的各个部分，通常提取自甘草的根部；在现有甘草组织培养时，由于培养液中的甘草总黄酮含量低，不太值得在产业化回收，因此未见报道从其培养液中回收总黄酮。但是，本专利技术人发现，经过在含有吐温的液体培养基中培养后，甘草毛状根和其培养液中的总黄酮含量都得到了显著的提升，都可以在产业上加以利用。因此，优选本专利技术第一方面还提供了培养甘草毛状根以提高甘草毛状根培养液中甘草总黄酮含量的方法，其包括：(1)将甘草毛状根在不含吐温的液体培养基中培养至旺盛生长期；(2)将步骤(1)得到的旺盛生长期的甘草毛状根在含有吐温的液体培养基中培养5天以上。甘草总黄酮中成分很多，即使其中黄酮类化合物的种类也有许多，但是可以通过其中的特定成分来表征。在本专利技术中，本专利技术获得的甘草总黄酮这一混合物可以通过其中的黄酮类化合物、甘草查尔酮A和/或光甘草定的含量来表征。因此，本专利技术第一方面的方法能提高黄酮类化合物、甘草查尔酮A和/或光甘草定的含量。如上文所述，本专利技术尤其能提高甘草毛状根培养液中的甘草总黄酮的含量，提高的黄酮类化合物、甘草查尔酮A和/或光甘草定的含量不仅体现在甘草毛状根中，也体现在其培养液中，因此优选本专利技术第一方面的方法能提高甘草毛状根培养液中黄酮类化合物、甘草查尔酮A和/或光甘草定的含量5倍以上，优选能提高10倍以上，如10-60倍。在本专利技术第一方面的方法中，还可以进一步包括收集产物的步骤，包括收集步骤(2)得到的甘草毛状根或其培养液，更优选本专利技术第一方面的方法还进一步包括：(3)收集步骤(2)得到的甘草毛状根和其培养液。这样，回收甘草毛状根和其培养液，分别可以提取其中的总黄酮，可以更有效地利用培养得到的总黄酮，避免浪费；-->同时，由于培养液中的总黄酮含量较高，使得提取培养液中总黄酮的成本较低，尤其可以利用本专利技术第四方面的方法进行，通过乙醇的梯度洗脱就可以从培养液中提纯获得甘草总黄酮。在本专利技术第一方面的方法中，甘草可以先在固体培养基上培养，然后再转接入不含吐温的液体培养基中培养至旺盛生长期。通常可以将健康的甘草毛状根以0.5％～2％的接种量接种于培养基中培养5～10天，从而达到旺盛生长期。在本专利技术的一个具体实施方式中，将湿重为1g的无褐化死亡部分的毛状根接种于100mL MS液体培养基中于25℃避光摇床培养7天，达到旺盛生长期。优选在本专利技术第一方面的方法中，吐温可以是经如本申请实施例所述测试证实能诱导甘草提高总黄酮含量的吐温种类，在本专利技术的具体实施方式中，该种类是吐温-80。另外，优选液体培养基中吐温的质量百分比浓度为1～5％(w/w)，更优选为2％(w/w)，具体而言，优选液体培养基中吐温-80的质量百分比浓度为1～5％(w/w)，更优选为2％(w/w)。优选在本专利技术第一方面的方法中，优选液体培养基为MS液体培养基。甘草毛状根可以在液体培养基中以合适条件被培养，优选其中培养的条件为20～30℃避光摇床培养5天以上，如7～21天，优选如10～20天，更优选其中培养的条件为25℃、黑暗、在100rpm转速的摇床上培养1本文档来自技高网...

【技术保护点】
培养能提高甘草总黄酮含量的甘草毛状根和／或甘草毛状根培养液的方法，其包括：（１）将甘草毛状根在不含吐温的液体培养基中培养至旺盛生长期；（２）将步骤（１）得到的旺盛生长期的甘草毛状根在含有吐温的液体培养基中培养５天以上。

【技术特征摘要】
CN 2009-9-8 200910092246.51.培养能提高甘草总黄酮含量的甘草毛状根和/或甘草毛状根培养液的方法，其包括：(1)将甘草毛状根在不含吐温的液体培养基中培养至旺盛生长期；(2)将步骤(1)得到的旺盛生长期的甘草毛状根在含有吐温的液体培养基中培养5天以上。2.权利要求1所述的方法，其进一步包括：(3)收集步骤(2)得到的甘草毛状根和其培养液。3.权利要求1或2所述的方法，其中吐温是吐温-80，优选液体培养基中吐温-80的质量百分比浓度为1～5％(w/w)，更优选为2％(w/w)。4.权利要求1或2所述的方法，其中液体培养基为MS液体培养基，优选其中培养的条件为20～30℃避光摇床培养10～20天，更优选为25℃、黑暗、在100rpm转速的摇床上培养15天.。5.权利要求1或2所述的方法，其能提高黄酮、甘草查尔酮A和/或光甘草定的含量，尤其能提高甘草毛状根培养液中黄酮、甘草查尔酮A和/或光甘草定的含量5倍以上，优选能提高10倍以上。6.权利要求1至5之任一所述的方法在制备提高甘草总黄酮含量的甘草毛状根和/或提高甘草总黄酮含量的甘草毛状根培养液的方法中的应用。7.制备甘草总黄酮的方法，其包括：(1)进行权利要求1至5之任一所述的方法，获得甘草毛状根；(2)干燥步骤(1)得到的甘草毛状根，用其重量10-20倍的水于60℃-100℃提取2-8小时，保留固体部分并将固体部分于烘箱中以30℃-60℃干燥；(3)干燥步骤(2)得到的固体部分，并用50-95％(v/v)乙醇于60℃-100℃提取1...

【专利技术属性】
技术研发人员：詹姆斯周，高春春，刘敬梅，陈春燕，李毅，
申请(专利权)人：北京未名凯拓农业生物技术有限公司，北京未名宝生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]