本发明专利技术公开了一种诱导胚状体形成和植物再生的植物双元表达载体，包含ＢＢＭ基因和ＦＬＰ－ＦＲＴ位点特异性重组系统，ＦＬＰ－ＦＲＴ位点特异性重组系统包含ＦＬＰ基因和两个同向ＦＲＴ位点，ＢＢＭ基因和ＦＬＰ基因位于两个同向ＦＲＴ位点之间，ＢＢＭ基因由组成型启动子控制，ＦＬＰ基因由诱导型启动子控制；还公开了构建该植物双元表达载体的方法及利用该植物双元表达载体诱导胚状体形成和植物再生的方法；本发明专利技术不仅可以促进植物愈伤组织形成胚状体，再诱导形成转基因植株，显著提高植物的转化频率和再生频率，而且可以消除外源基因对转基因植株的负面影响，为难以进行遗传转化的植物品种提供了一种新的遗传转化策略，具有广阔的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种重组表达载体，特别涉及一种诱导胚状体形成和植物再生 的植物双元表达载体，还涉及该表达载体的构建方法和应用。
技术介绍
利用基因工程技术把特定的外源基因导入植物受体中，达到改变植物性状 (如抗虫、抗病、抗逆等)以及快速培育植物新品种的目的，是现代遗传育种 的重要途径。植物基因工程的核心是植物的遗传转化。植物遗传转化方法主要分为两类 即利用载体系统转化(如农杆菌介导法、脂质体法等)和直接遗传转化(如基 因枪法、PEG法、电激法、显微注射法、花粉管通道法、超声波法等)。其中， 农杆菌介导法是采用含有目的基因的农杆菌浸染植物受体，通过诱导抗性植物 再生从而获得转基因植抹。由于其具有易操作、低费用、高效率、插入片段确 定性好和转基因拷贝数低等独特优点，已经成为植物遗传转化的首选方法。目 前，通过农杆菌介导方法获得转基因植抹的植物已达100种以上，包括水稻、 玉米、马铃薯、棉花、大豆、油菜、番茄、黄瓜、苜蓿、核桃、蔬菜和牧草等。 但是，该方法仍然存在以下问题(1) 一些重要植物(如木本植物、单子叶植 物)的转化频率低，转化植抹难于再生；(2)同种植物不同品种之间的转化频 率和再生频率差异大；(3 ) —些在生产上运用较广的植物品种难以进行遗传转 化等。研究发现，存在上述问题的主要原因在于植物再生困难，组织培养中 无法获得再生苗。
技术实现思路
有鉴于此，为克服现有植物遗传转化技术存在的不足，本专利技术的目的之一6在于提供一种诱导胚状体形成和植物再生的植物双元表达载体，不仅可以利用 外源基因的超量表达促进植物愈伤组织形成胚状体，再诱导形成转基因植林， 显著提高植物的转化频率和再生频率，而且可以从转基因植抹的基因组中有效 地删除外源基因，以消除外源基因的超量表达对转基因植抹的负面影响。为达到此目的，本专利技术的植物双元表达载体，包含Aii1/基因和FLP-FRT位 点特异性重组系统，所述FLP-FRT位点特异性重组系统包含FLP基因和两个同 向FRT位点，所述i9iW基因和FLP基因位于两个同向FRT位点之间，^gfil/基因由 组成型启动子控制，FLP基因由诱导型启动子控制。进一步，所述组成型启动子选自花椰菜花叶病毒(CaMV) 35S启动子、甘露 碱合成酶基因(mas)启动子或章鱼碱合成酶基因(ocs)启动子；进一步，所述诱导型启动子选自热激启动子HSP18. 2、 Gmhspl7. 5-E或 Gmhspl7. 5C;进一步，所述植物为双子叶植物；进一步，所述双子叶植物为杨树；进一步，所述才直物双元表达载体为pLFFLPBBM。胚状体诱导是植物组织培养的常用方法，具有增殖率高、可免去生根步骤 等优点。AiW(BABY BOOM)基因(核苷酸序列如SEQ ID No.l4所示)来自于油 菜(Brassica napus )，为AP2/ERF家族成员，在发育的胚中特异性表达，可以 促进细胞分裂和体细胞胚胎的形态发生变化，起诱导植物激素的作用或提高细 胞对激素的敏感性。朋W基因超量表达，可以使外植体在没有外源激素的条件下 产生大量的胚状体，显著提高植物的再生频率。FLP-FRT位点特异性重组系统来自于啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae ) 细胞核内2 ^im质粒，由FLP基因(核苷酸序列如SEQ ID No. 15所示)和FLP 重组识别位点(FLP recognition target, FRT)组成，重组酶FLP可催化位于 同一分子上两个同向FRT ( loxPFRT)位点间DNA片段的切除。由于55#基因的 超量表达会对转基因植抹产生一些负面影响，如植物矮化、形成玫瑰型叶片、花器官异型和降低植物育性等，在AW基因发挥完诱导胚状体形成和植物再生的作用后，在转基因植林中诱导FLP表达，催化位于5fil/基因两侧loxPFRT位 点间的重组反应，即可从转基因植抹的基因组中有效地删除朋#基因，消除其 对转基因植林的负面影响。植物基因启动子是重要的顺式作用元件，处于基因转录调控的中心环节。 组成型启动子(constitutive promoter)是指在该类启动子控制下，结构基因 的表达在一定水平上保持恒定，在不同组织、部位表达水平没有明显差异，包 括但不限于CaMV 35S启动子、mas启动子和ocs启动子。诱导型启动子 (inducible promoter)是指在某些特定的物理或化学信号的刺激下，该类启 动子可以大幅度地提高基因的转录水平，如光诱导表达基因启动子、热诱导表 达基因启动子等，其中热诱导表达基因启动子包括但不限于 HSP18. 2 (Characterizat ion of two genes encoding smal 1 heat-shock proteins in Arabidopsis thaiiana. Takahashi T et al. Mo 1 Gen Genet, Vol. 219， 365 ~ 372， 1989) 、 Gmhspl7. 5-E ( DNA sequence and transcript mapping of a soybean gene encoding a small heat-shock protein. Czarnecka E et al. Proc Natl Acad Sci USA, Vol. 82， 3726 ~ 3730， 1985 )和Gmhspl7. 5C ( A heat shock-switchable gene expression system. Chen M et al. Agr Sci China, Vol. 2， 722 ~ 728. 2003.)。在植物双元表达载体pLFFLPBBM中，朋W基因和FLP基因位于两个同向FRT 位点之间，AW基因由CaMV 35S启动子控制，FLP基因由热激启动子HSP18. 2 控制，FLP基因位于i ^/基因的上游。当然，FLP基因也可位于》_5#基因的下游， 同样可以达到专利技术目的。本专利技术的目的之二在于提供一种构建所述植物双元表达载体的方法，操作 筒便、成本低廉。为达到此目的，本专利技术的构建所述植物双元表达载体的方法，包括以下步骤a、 DNA片段loxPFRT-MCS-loxPFRT的制备人工合成包含两个同向FRT位点以及fcdll、 //wl、 iWI、 ^cl、 和 I酶切位点的DNA片段loxPFRT-MCS-loxPFRT，其核普酸序列如SEQ ID No. 1 所示；b、 中间载体pHSP-FLP-NOSl的构建bl、以载体pBI121为模板，以核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示的引物N0S1-F 和核苷S臾序列如SEQ IDNo. 3所示的引物N0S1-R为上、下游引物进行PCR扩增， 获得包含终止子NOS且5，端含有酶切位点、3，端含有^cl酶切位点的DNA 片段I ;b2、以载体pTT119为^t板，以核苷酸序列如SEQ ID No. 4所示的引物 HSP18. 2-F和核苷酸序列如SEQ ID No. 5所示的引物HSP18, 2-R为上、下游引物 进行PCR扩增，获得包含热激启动子HSP18. 2且5'端含有//w本文档来自技高网...
【技术保护点】
诱导胚状体形成和植物再生的植物双元表达载体，其特征在于：包含ＢＢＭ基因和ＦＬＰ－ＦＲＴ位点特异性重组系统，所述ＦＬＰ－ＦＲＴ位点特异性重组系统包含ＦＬＰ基因和两个同向ＦＲＴ位点，所述ＢＢＭ基因和ＦＬＰ基因位于两个同向ＦＲＴ位点之间，ＢＢＭ基因由组成型启动子控制，ＦＬＰ基因由诱导型启动子控制。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：邓伟，李正国，杨迎武，罗克明，金凯，
申请(专利权)人：重庆大学，
类型：发明
国别省市：85[中国|重庆]
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。