转基因改良禾谷类作物籽粒淀粉品质的方法，其特征是分别构建淀粉分支酶基因和参与植物糖酵解及ＴＣＡ循环的一个或多个代谢酶的基因ＲＮＡ干涉表达载体，通过农杆菌介导或者基因枪转化把目的干涉片段整合到植物基因组中，特异性地抑制植物淀粉分支酶和参与植物糖酵解及ＴＣＡ循环的一个或多个代谢酶的基因活性，从而提高作物籽粒淀粉中直链淀粉的比例和籽粒总淀粉的含量。采用本方法可以方便、有效地改良禾谷类作物籽粒淀粉品质。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及改良禾谷类作物籽粒淀粉品质的方法，更具体地说是通过RNA干涉转基因技术改良禾谷类作物籽粒淀粉品质的方法。
技术介绍
禾谷类作物如玉米作为工业原料最主要的成份就是淀粉，由于玉米淀粉加工不受季节限制，淀粉质量较好，籽粒中淀粉含量达64％-78％，且具有综合利用效益高和较薯类淀粉易于回收等特点，所以世界淀粉市场的81.8％为玉米淀粉，美国淀粉加工业95％的淀粉为玉米淀粉。通常所说的玉米淀粉是直链淀粉(amylose)和支链淀粉(amylopectin)的混合物。目前，国内外玉米品种淀粉的含量多为籽粒干重的60％左右，其中直链淀粉为22％左右，支链淀粉为78％左右。而在工业上得到广泛应用的是直链淀粉，涉及食品、医疗、纺织、造纸、环保等30多个领域。直链淀粉，尤其是经过理化修饰后的直链淀粉功能进一步加强，如将直链淀粉进行溶解，与氢键结合，可形成刚性不透明胶体，这一特性用于糖果业，可以使糖果保持固定的形状和完整的造型；直链淀粉还用于食品业的增厚剂、固定剂、炸薯条中阻止过度吸油分的包衣剂；利用直链淀粉取代聚苯乙烯生产可降解塑料，这种塑料具有大量应用于包装工业、农用薄膜加工业和从根本上解决白色污染问题的潜能。在禾谷类作物研究上，获得高水平的直链淀粉同时并不明显减少淀粉总含量的突破是1952年Vineyard和Bear发现了位于玉米第5条染色体上的ae(amylose extender)基因。遗传研究表明高直链淀粉主要是由ae基因控制的，ae基因及其修饰基因的协同作用可使玉米淀粉中直链淀粉的含量提高到50-80％。位于第五连锁群上的ae基因目前已被SSR连锁标记，已从高淀粉玉米中克隆了ae基因，该基因共有23449bp，其在Genebank中的接受号为AF072725。这些为该性状的转移和利用提供了重要的种质资源和基因资源，但由于该基因较大，不易操作，同时该基因表达伴随其它农艺性状变劣、籽粒产量低，应用受到限制。另外，由于高直链淀粉的遗传十分复杂，采用常规杂交、回交转育和轮回选择等育种方法，所需群体要足够大，且周期长、分析样品多，因此投入也较多。基因工程改变淀粉质量集中于GBSS，SSS和SBE三种酶的操作上，主要使用技术1、正义和反义RNA转基因技术，即是通过导入某个酶基因的正义结构或反义结构，影响细胞内酶的含量或活性，引起目的基因的过量表达或使其表达受抑制，从而达到对淀粉结构的控制。Visser等人(1991)利用反义RNA技术，向马铃薯中导入反向连接的GBSS基因，导致GBSS基因含量和活性下降，进而导致马铃薯块茎中直链淀粉含量锐减(减少70％-100％)。同样地利用反义RNA技术，在木薯(Salehuzzman，1993)、水稻等植物中，也获得了低(或无)直链淀粉的转化体。国际专利WO9722703A2报道了应用反义RNA技术将玉米sbe2b基因的全长cDNA转化玉米的研究，结果获得了籽粒淀粉中直链淀粉含量较高的转基因玉米。然而反义技术的应用存在一定的局限性，其对内源性基因表达的抑制较弱，往往产生过渡性的表型，会妨碍对目的基因功能的准确判断。其抑制效应遗传稳定性较差，不能稳定可靠地降低目的基因的表达。2、基因敲除技术和DNA/RNA嵌合分子介导的基因转变技术，但该方法一次只能研究一个基因，不能有效地对多基因家族进行敲除。一些在动植物发育过程中有关键作用的基因，如果在DNA水平采用基因敲除或突变进行可遗传的修饰，则会过早地基因沉默，产生致死表型，因而无法深入研究。
技术实现思路
本专利技术是为避免上述现有技术所存在的不足之处，提供一种简便高效、遗传稳定性好、特异性和可操作性强的。本专利技术解决技术问题所采用的技术方案是本专利技术方法的特点是分别构建淀粉分支酶基因和参与植物糖酵解及TCA循环的一个或多个代谢酶的基因RNA干涉表达载体，通过农杆菌介导或者基因枪转化把目的干涉片段整合到植物基因组中，特异性地抑制植物淀粉分支酶和参与植物糖酵解及TCA循环的一个或多个代谢酶的基因活性，从而提高作物籽粒淀粉中直链淀粉的比例和籽粒总淀粉的含量。与已有技术相比，本专利技术的优点体现在1、本专利技术是利用RNA干涉技术进行禾谷类作物淀粉品质改良。这是RNA干涉技术首次在该领域进行研究与运用，也是本专利技术的独创之处。RNA干涉技术具有高效性、特异性、可遗传性、操作简单等特点，这是传统的基因敲除技术和反义RNA技术所无法比拟的。2、在受体选择上，传统的基因敲除技术和反义RNA技术所要研究的受体一般是完整的基因序列，对于基因序列不明确的受体，具有明显的局限性。而利用RNA干涉技术，只需要知道与受体同源的基因片段，就可对受体进行研究，因此，研究范围较为广泛。3、在操作方法上，反义RNA技术一般要构建的是含数千个碱基对的大片段，操作起来较为困难，而RNA干涉技术中所要构建的载体仅仅是含有几十到几百个碱基对的小片段，操作简单、方便，易于运用。另外，一个基因可选择一到多个干涉片段，可对这些片段或组合进行干涉效果的分析、优化，以获得最有效的片段。4、在遗传稳定性上，利用传统的反义RNA技术，因全基因转化对受体影响大，通常会导致受体产生较大变异，且遗传稳定性较差，难以得到优良的转基因作物，但采用该技术转化的RNA干涉片段小，对受体其它农艺性状影响小，遗传稳定性高，便于获得对目的基因干涉而其它农艺性状优良的转基因植株。附图说明图1为PCR扩增片段电泳检测图谱。图中，MDNA标准分子量；1-6分别为从玉米品种鲁原92、52106、昌72、郑58、543、联87的基因组DNA中扩增的特异片段。图2为pUCCRNAi质粒Pst I酶切验证和BamH I、Sal I双酶切后纯化图。图中，MDNA标准分子量；1-2pUCCRNAi质粒Pst I酶切验证；3-4PCR产物BamHI、Sal I双酶切纯化的片段；5-6pUCCRNAi质粒BamH I、Sal I双酶切纯化的片段。图3为RNAi+1F质粒Pst I酶切验证电泳图谱。图中，M1Marker(λDNA/Hind III)、M2DL2000 DNA Marker，泳道1为对照pUCCRNAi/pstI产物；2、3、4、5、6和7为(RNAi+1F)/pstI产物，其中1F为纯化后的鲁原92、52106、昌72、郑58、543、联87的基因组DNA中扩增的特异片段图4为.RNAi+2F质粒Pst I酶切验证电泳图谱。具体实施方案操作步骤a、根据作物淀粉分支酶基因或参与植物糖酵解和TCA循环的一个或多个代谢酶基因的序列，通过序列比对，确定作物中淀粉分支酶基因的特异性RNA干涉序列为ttcatgacatctgat caccagtata tttcccggaa acatgaggag gataaggtga ttgtgttcga aaagggagat ttggtatttg tgttcaacttccactgcaac aacagctatt ttgactaccg tattggttgt cgaaagcctg gggtgtataa和参与植物糖酵解和TCA循环的一个或多个代谢酶基因的特异性RNA干涉序列为tcaatgtgg ccgtcatggt tggtggattccccaggaagg agggaatgga aaggaaagat 本文档来自技高网...
【技术保护点】
转基因改良禾谷类作物籽粒淀粉品质的方法，其特征是分别构建淀粉分支酶基因和参与植物糖酵解及ＴＣＡ循环的一个或多个代谢酶的基因ＲＮＡ干涉表达载体，通过农杆菌介导或者基因枪转化把目的干涉片段整合到植物基因组中，特异性地抑制植物淀粉分支酶和参与植物糖酵解及ＴＣＡ循环的一个或多个代谢酶的基因活性，从而提高作物籽粒淀粉中直链淀粉的比例和籽粒总淀粉的含量。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：程备久，朱苏文，张永风，项艳，江海洋，叶辉，陶芳，程郢，
申请(专利权)人：安徽农业大学，
类型：发明
国别省市：34[中国|安徽]
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