本发明专利技术建立由自然杀伤细胞（ＮＫ细胞）介导的肝炎模型的方法，特征是选择一种病毒模拟物聚肌胞（Ｐｏｌｙ ＩＣ）以７．５－２０微克／克体重剂量，通过腹腔注射或静脉注射６－８周龄纯系ＢＡＬＢ／ｃ或Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ小鼠，Ｐｏｌｙ ＩＣ注射后１２－２４小时血清丙氨酸氨基转移酶和天门冬氨酸氨基转移酶显著升高，肝脏组织学出现肝细胞点状坏死，局部炎性细胞浸润，肝内ＮＫ细胞比例及绝对数升高。该模型的建立为系统研究肝炎的发病机制以及筛选有价值的护肝药物及疗效观察提供有力的工具。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属肝脏免疫学和实验动物学
，具体涉及建立由自然杀伤细胞(NK细胞)介导的肝炎动物模型的方法。
技术介绍
肝炎是严重危害人民生命健康且死亡率较高的一种疾病，病因主要包括病毒感染、过度酒精摄入和服入化学毒物等造成肝脏实质细胞的破坏，其致病机制复杂。其中肝脏免疫损伤备受关注，特别是肝脏淋巴细胞参与的病理损伤已经成为多种肝炎发病机制中至关重要的事件。研究淋巴细胞如何参与肝脏损伤将有助于了解肝炎的致病机制，将促进肝脏疾病的预防及治疗。由于人体肝脏标本的缺乏以及体外研究的局限性，建立系列由免疫细胞介导的肝炎模型模拟人类肝脏疾病将是首选方法。美国《临床调查杂志》(Journal of Clinical Investigation，1992；90196-203)报道了由刀豆蛋白(concanavalin A)诱导的肝炎模型，该模型是将刀豆蛋白以15微克/克体重(μg/g.wt)静脉注射BALB/c小鼠(中文简称小白鼠)，所致的肝脏损伤是T细胞依赖的。美国《美国国家科学院进展》(Proceedings of the National Academy of Sciences.U S A.2000；975498-5503)报道了自然杀伤T细胞(NKT细胞)通过Fas配体(FasL)介导的细胞毒活性参与刀豆蛋白诱导的肝炎模型；美国《美国病理学杂志》(American Journal of Pathology.2000；1571671-1683)报道了巨噬细胞通过分泌肿瘤坏死因子(TNF)参与刀豆蛋白诱导的肝炎模型。除了刀豆蛋白诱导的肝炎模型外，美国《美国国家科学院进展》(1979；765939-5943)报道的半乳糖胺/脂多糖(Galactosamine/lipopolysaccharide)联合诱导的肝脏损伤也是常用的肝炎模型，美国《美国生理学杂志-胃肠道和肝脏生理学分册》(American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology.2001；280G720-8)报道该模型是枯否氏细胞依赖的。综上所述，到目前为止，T细胞、NKT细胞和枯否氏细胞在已经报道的肝炎模型中的作用已经得到清楚地阐明，而NK细胞在这些肝炎模型中的确切作用尚未见报道。虽然美国《免疫学杂志》(Journal of Immunology，1983；1311531-1538)和美国《白细胞生物学杂志》(Journal of Leukocyte Biology，2004；76743-59)分别报道了NK细胞在小鼠巨细胞病毒(MCMV)和丙型肝炎病毒(HCV)感染引起的肝脏实质细胞损伤中的发挥重要作用，但是由于缺乏人体肝脏标本以及MCMV和HCV感染模型建立的繁琐，安全因素等限制，特别是由于缺乏合适的由NK细胞介导的肝炎模型，NK细胞在肝脏损伤中的详细致病机制仍未获得很大进展。因此，为了更好、更方便地研究NK细胞在肝炎免疫损伤中的作用，以及筛选有价值的护肝药物、疗效观察研究，有必要建立由NK细胞介导的肝炎动物模型，但迄今未见有关于由NK细胞介导的肝炎模型的报的报道。
技术实现思路
本专利技术提出一种建立由NK细胞介导的肝炎动物模型的方法，以建立一种由NK细胞介导的肝炎模型，克服现有免疫细胞相关的肝炎模型中没有NK细胞参与的不足。可用于肝脏NK细胞在肝炎致病机制中的作用研究以及护肝药物的筛选和疗效观察。本专利技术建立由NK细胞介导的肝炎动物模型的方法，其特征在于包括以下步骤1、小鼠的准备从纯系BALB/c小鼠、纯系C57BL/6J小鼠(中文简称B6小鼠)、纯系严重联合免疫缺陷病(SCID)小鼠、纯系BALB/c背景的裸鼠(nude mice)或纯系BALB/c背景的分化抗原(CD)1d缺陷小鼠中选择至少一组小鼠；2、聚肌胞(Polyinosinic-Polycytidylic Acid，简称Poly IC)的准备用无菌PH7.0磷酸盐缓冲溶液(PBS溶液)配制终浓度为1毫克/毫升(mg/ml)的Poly IC溶液，封装备用，-20℃保存；3、对不同品系小鼠进行Poly IC腹腔或静脉注射将步骤2中所配制的1mg/ml PolyIC溶液，对每种品系小鼠分别进行腹腔注射或静脉注射Poly IC溶液，每克小鼠体重剂量范围为7.5-20μg；4、不同品系小鼠Poly IC注射后的处理摘取Poly IC注射后12-24小时小鼠的眼球，收集血液后分离血清，做血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天门冬氨酸氨基转移酶(AST)检测；同时收集小鼠肝脏标本，做苏木精/伊红(H&E)染色后，显微镜观察肝脏组织学变化若血清ALT和AST升高至60-200国际单位/升(IU/L)，肝脏组织学出现肝细胞点状坏死，局部炎性细胞浸润，则肝炎模型建立成功；若无上述现象则肝炎模型未建立成功。本专利技术方法中一般采用6-8周BALB/c或C57BL/6J小鼠，因大于8周的小鼠肝脏损伤不明显。本专利技术中的Poly IC注射途径可以采用腹腔注射，也可以采用静脉注射，在相同剂量下两者肝脏损伤无显著差异，但采用腹腔注射较方便。本专利技术方法中常采用的两种品系BALB/c和C57BL/6J小鼠，在相同剂量Poly IC、相同注射途径时，C57BL/6J小鼠肝脏损伤程度较BALB/c小鼠损伤程度为重。肝脏损伤的严重程度与Poly IC注射所用剂量有关，C57BL/6J小鼠接受7.5μg/g.wtPoly IC腹腔注射时，肝脏损伤较轻；C57BL/6J小鼠接受30μg/g.wt Poly IC腹腔注射时肝脏损伤较重，且死亡率增加；一般以Poly IC 20μg/g.wt注射C57BL/6J小鼠为最佳，小鼠死亡率小于5％。在刀豆蛋白诱导的肝炎模型中，注射刀豆蛋白可以诱导BALB/c小鼠和C57BL/6J小鼠产生肝脏损伤，因为SCID小鼠和裸鼠缺乏T细胞，CD1d缺陷小鼠存在NKT细胞功能缺陷，所以刀豆蛋白不能诱导SCID小鼠、裸鼠和CD1d缺陷小鼠产生肝脏损伤，而本专利技术中注射Poly IC不但可以诱导BALB/c小鼠和C57BL/6J小鼠产生肝脏损伤，而且可以诱导SCID小鼠、裸鼠和CD1d缺陷小鼠产生肝脏损伤。由于本专利技术采用的Poly IC是一种人工合成的双链核糖核酸(RNA)，能够刺激、活化NK细胞分泌干扰素。本专利技术的理论前提就是用大剂量Poly IC过度活化NK细胞，从而破坏肝脏实质细胞；而在刀豆蛋白诱导的肝炎模型中所使用的刀豆蛋白为T细胞刺激剂，主要是活化肝脏T细胞；在脂多糖诱导的肝炎模型中所使用的脂多糖可与枯否氏细胞表面的Toll样受体4(toll-like receptor 4，缩写TLR4)结合，活化枯否氏细胞。从所诱导的肝炎模型的性质来看，由于本专利技术中所采用的Poly IC是病毒模拟物，其刺激机体产生的反应类似于病毒感染反应，结合所诱导的肝脏组织病理损伤特点，PolyIC诱导肝脏损伤类似人类病毒性肝炎，由于Poly IC诱导的肝脏损伤是由于自身过度活化的NK细胞破坏了肝脏实质细胞，所以这种损伤又具有自身免疫性肝炎的特点；刀豆蛋白诱导的肝炎模型类似人类自身免疫性肝炎，具有爆发性肝炎特征；脂多糖诱导的肝炎模型类本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种建立由自然杀伤细胞介导的肝炎动物模型的方法，其特征在于包括以下步骤： （１）、从纯系小白鼠、纯系Ｂ６小鼠、纯系严重联合免疫缺陷病小鼠、纯系裸鼠或纯系分化抗原１ｄ缺陷小鼠中选择至少一组小鼠； （２）、用无菌ＰＨ７．０磷酸盐缓冲溶液配制终浓度为１毫克／毫升的聚肌胞溶液，封装备用，－２０℃保存； （３）、对每种品系小鼠分别腹腔注射或静脉注射上述聚肌胞溶液，每克体重剂量范围为７．５－２０μｇ； （４）、摘取聚肌胞注射后１２－２４小时小鼠的眼球，收集血液后分离血清，做血清丙氨酸氨基转移酶和天门冬氨酸氨基转移酶检测；同时收集小鼠肝脏标本，做苏木精／伊红染色后，显微镜观察肝脏组织学变化：血清丙氨酸氨基转移酶和天门冬氨酸氨基转移酶升高至６０－２００国际单位／升，肝脏组织学出现肝细胞点状坏死，局部炎性细胞浸润，则肝炎模型建立成功。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：田志刚，董忠军，魏海明，
申请(专利权)人：中国科学技术大学，
类型：发明
国别省市：34[中国|安徽]
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