本发明专利技术提供一种从蚯蚓总ＲＮＡ中通过ＲＴ－ＰＣＲ得到的基因Ｅ－ｔａｕ和该基因表达的蛋白质Ｅ－Ｔａｕ、含有上述基因序列的重组载体及其亚克隆和重组微生物，以及由该基因构建的真核表达载体、转染细胞系。该基因属于一种新的微管相关蛋白质Ｔａｕ的基因，其表达产物属于一种新的蛋白质。本领域已部分了解神经ｔａｕ与神经退行性疾病，特别是与早老性痴呆（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ，ＡＤ）的病理过程密切相关；该蛋白质具有促进微管装配和稳定微管网络的作用。本发明专利技术还涉及该基因在治疗神经退行性疾病中的应用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程领域，具体地说，本专利技术涉及编码一种蚯蚓的微管结合蛋白的基因Etau。本专利技术还涉及该基因编码的蛋白质功能、含有上述基因序列的重组载体及其亚克隆和重组微生物，以及由这些亚克隆获得到的真核表达载体及转染的细胞系。此外，本专利技术还涉及该基因在神经元微管组装中的作用及其临床医学中对神经退行性疾病研究的应用。
技术介绍
1975年，Weingarten等在研究神经元微管系统的分子结构过程中，发现了一种与微管蛋白质具有高亲和力的蛋白质，将其归类于微管结合蛋白(microtubule associated protein，MAP)，命名为神经tau。该蛋白质具有促进微管装配和稳定微管网络的作用，与信号转导、物质运输以及神经细胞发育相关。近十几年的研究显示，神经tau与神经退行性疾病，特别是与早老性痴呆(Alzheimer’s disease，AD)的病理过程密切相关。Tau的异常超磷酸化是神经纤维缠结(NFTs)的主要成分，而NFTs是AD等神经退行性疾病的一种重要的病理特征。1998年，Hutton等发现了17号染色体相关的帕金森氏病(Parkinson’s PD)样额颞叶痴呆(frontotemporaldementia with parkinsonsm linked to chromosome 17，FTDP-17)的病因是该染色体上的tau基因发生了突变。最近研究表明，该蛋白质也存在于神经细胞核内，能与DNA相互作用，具有稳定双螺旋结构的作用；还能与某些具有重要功能的蛋白质相互作用，表现出类似分子伴侣的功能。由于tau在AD等神经退行性疾病病理机制研究中的重要地位，使其成为微管结合蛋白家族中最受瞩目的成员之一。自从tau首先从成体脑组织中被提取出来，人们就知道它以几种形式(异构体)存在，后来发现这是发育调控的结果(Matus，1988)。分子克隆研究现已发现成体哺乳动物的神经系统中至少存在六种tau蛋白质异构体，它们来源于同一个基因，经mRNA转录后的不同剪接而得到。Tau基因位于17号染色体上，它在种系间高度保守。迄今为止，已经从小鼠、大鼠、牛以及人类的表达库中获得了tau的克隆(Lee等，1988；Goedert等，1988；Goedert等，1989a；Himmler，1989a；Himmler等，1989b；Mori等，1989；Kosik等，1989；Kanai等，1989；Goedert等，1989b)。目前以全长cDNA克隆形式被分离出来的六种人类tau的异构体分别由352-441个氨基酸组成，差别主要在于三个插入序列的存在与否(Goedert等，1988；Goedert等，1989a；Goedert等，1989b；Goedert和Jakes，1990)。与tau蛋白质沉积相关的病症并不只限于阿尔茨海默病，在许多中枢神经系统疾病中也可以观察到，诸如皮克病(心包性假性肝硬变)和进行性核上麻痹(Joachim等，1987)。除此之外，还发现在大部分老龄的唐氏综合症患者脑中tau是配对螺旋样纤维的组成部分。这提示对于多种神经细胞的损伤，tau可能以一种相对非专一性的方式被影响。换句话说，tau的不同修饰，每一种针对特定的疾病，可能导致相似的神经纤维缠结的形成。Tau是阿尔茨海默病病理学研究中的关键分子之一，并且与其他几种神经退行性疾病有关(Grundke-Iqbal等，1986a；Grundke-Iqbal等，1986b；Iqbal等，1986)。统计数字显示，所有与tau有关的病理学占据了痴呆病的75％。在这些神经系统的疾病中，家族遗传性额颞页痴呆引起了广泛的关注。此种家族性痴呆的患者，其tau基因发生了某些错义突变(Poorkaj等，1998；Hutton等，1998；Spillantini等，1998)，表明tau蛋白质的单基因突变引发其积累和加工的异常可以直接导致痴呆产生。为了弄清阿尔茨海默病及其他与tau蛋白质有关的病理学过程的分子机制，了解tau蛋白质各方面的功能是十分必要的。Tau最初是以一种重要的脑微管结合蛋白被发现的，它可以促进微管的组装并稳定后者的结构(Weingarten等，1975)。90年代，几个实验室分别报道了tau存在于多种细胞株系的细胞核中(Loomis等，1990；Davisand Johnson，1999)，Greenwood等人发现核tau与DNA有直接或间接的结合(Greenwood and Johnson，1995)，因此推测tau蛋白质除作为微管结合蛋白外，还具有其他的功能。弄清tau的功能无疑将会有助于阐明阿尔茨海默病及其他与tau蛋白质相关的病理学过程的分子机制。到目前为止，尽管已经在许多动物种类中发现了Tau蛋白质并对其功能做了大量研究，但是从未见在蚯蚓中发现Tau蛋白质的报道。根据果蝇、大鼠、小鼠及人类的Tau结构的保守性，本专利技术人从蚯蚓身体部分及神经节部分的总RNA中，通过RT-PCR发现一个新的Tau基因，命名为Etau，并且对其限制性酶谱、序列及表达的蛋白质进行了分析，并得到了多克隆抗体。此外，本专利技术人还研究了该基因在真核细胞中的表达模式，发现该基因与微管的组装及与信号转导、物质运输以及神经细胞发育相关。
技术实现思路
本专利技术提供一种从蚯蚓总RNA中通过RT-PCR得到的基因E-tau和该基因表达的蛋白质E-Tau、含有上述基因序列的重组载体及其亚克隆和重组微生物，以及由该基因构建的真核表达载体、转染细胞系。该基因属于一种新的微管相关蛋白质Tau的基因，其表达产物属于一种新的蛋白质。本领域已部分了解神经Tau蛋白质具有促进微管装配和稳定微管网络的作用，与信号转导、物质运输以及神经细胞发育相关；神经tau与神经退行性疾病，特别是与早老性痴呆(Alzheimer’s disease，AD)的病理过程密切相关。本专利技术还涉及该基因表达的蛋白质E-Tau在制备治疗神经退行性疾病的药物中的应用，该神经退行性疾病特别是早老性痴呆。本专利技术提供的基因Etau具有如SEQ ID NO.1所示的多核苷酸序列。另一方面，该基因中的一个或多个碱基的缺失、插入或替代产生具有与SEQ ID NO.1所示序列具有相同功能的变异体也应包括在本专利技术的内容之内。因此，本专利技术应当包括具有SEQ ID NO.1所示序列的多核苷酸的变异体，这些变异体的序列与SEQ ID NO.1所示序列的同源性至少为80％，优选的至少为90％。所以本专利技术还提供了该基因的变异体的片段。另一方面，本专利技术提供含有该基因及其变异体或其片段的重组载体。选择的载体通常能在使用的特定宿主细胞内发挥功能，也就是说，载体与宿主细胞兼容，从而能实现基因的扩增和(或)基因的表达。在本专利技术的一个实施方案中，上述载体是pET28a(NOVAGEN)，插入的是Etau或其片段，插入位点可以是Nco I和Xho I或EcoR I和BamH I等。用于实现本专利技术的优选载体是能够与细菌、酵母和哺乳动物宿主细胞相容的那些载体。其中尤其包括pCRII、pCR3和pcDNA3.1(Invitrogen，SanDiego，CA)、pB SII(Stratagene，La Jolla，CA)、pET 15(Novag本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种多核苷酸，该多核苷酸的序列与ＳＥＱＩＤＮＯ．１所示序列的同源性至少为８０％。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：赫荣乔，赵静，王东亮，王兴胜，赫坚，
申请(专利权)人：中国科学院生物物理研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]
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