HIV药物疫苗制造技术

本发明专利技术涉及一种重组多肽，其包含的氨基酸序列来源于ＨＩＶ　　ｇａｇ基因产物、ＨＩＶ　　ｐｏｌ基因产物、或ＨＩＶ　　ｎｅｆ基因产物中的至少一种，该氨基酸序列与上述基因产物的天然序列相比较被突变并且保留了如详述于实施例８所示的ｐ１７和ｐ２４（ｇａｇ）、ＲＴ（ｐｏｌ）的氨基酸１－４４０和ｎｅｆ的基因产物的每个天然ＣＤ８＋Ｔ细胞表位。本发明专利技术还涉及编码上述多肽的核酸和病毒载体及它们在药物、免疫和疫苗中的应用。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及包含HIV抗原的多肽，尤其涉及包含突变的HIV序列的多肽，该突变序列保留了它们天然的CD8+表位。而且本专利技术涉及引入了附加的辅助T细胞表位的突变HIV序列。
技术介绍
人类免疫缺陷病毒(HIV)是一种致病病毒，可以导致虚弱和致死的免疫缺陷，例如，艾滋病。尽管有一些可以延长预期寿命，增加感染个体的生命质量的疗法，例如对于艾滋病，但是此疾病通常是致命的。消灭或者控制HIV感染病人体内的病毒是一个难题。预防HIV感染是一个难题，迄今大部分仍无法为社会所解决，例如限制性行为和/或者加强皮下注射针的使用者采用灭菌操作。药物预防HIV感染仍然是一个先进的研究领域。需要有效的HIV免疫对策被发现。即使产生了针对HIV病毒粒子某些单元的免疫反应，但仍然存在一些可改善免疫反应的问题，包括优势免疫，病毒逃逸和病毒蛋白的递呈。显然，HIV病毒粒子应用于疫苗是非常危险的。此外，如果与天然蛋白相同的蛋白具有不良的效果，那么它们的应用本身也是有问题的。而且，这些蛋白本身具有免疫抑制性和/或者缺乏足够的CD8+T细胞表位，不能引起合适的强或广的免疫反应。由CD8+T细胞的突变，尤其是优势免疫的CD8+T细胞表位的突变能引起病毒逃逸，病毒逃逸是病毒免疫中的一个重要难题。当前的疫苗不能够募集辅助T细胞，因此产生的免疫反应范围窄和/或者弱。天然的病毒序列受体内进化压力影响也许含相对较少的免疫显著表位。此外，优势免疫效应能够改变某些CD8+T细胞表位的临床价值，使免疫反应集中于这些表位。很明显地，这足以强调优势免疫的问题，例如导致在该表位突变的病毒系的亚选择，可以导致潜在的致死的病毒逃逸(例如，见Barouch et al.2002 Nature415 p.335)。申请WO02/32943(Nabel and Huang)揭示HIV基因ENV，GAG和POL的修饰能够增强基因免疫的免疫原性。尤其是，这些修饰集中在ENV的糖基化，集中在编码delta CFI HIV ENV的核酸构建体。此外，ENV切割位点和融合区的特异性缺失，及7个重复基因1和2的间隔也被揭示。还描述了用编码GAG或编码GAG-POL的DNA质粒进行免疫，用GAG-POL质粒免疫的效果最好。申请WO02/32943的大部分内容是关于揭示列于表1和WO02/32943的权利要求的特定质粒。还要求保护这些质粒不同部分的类似物，及至少95％的序列一致性的片段。为了破坏Nef的功能，例如申请WO02/32943中限制I类主要组织相容性复合物(MHC)和/或CD4的表达，在HIV-1PV22的nef基因中引入点突变。PV22与HXB2参考序列(见实施例8)在突变位点上一致。因此可以看出申请WO02/32943中的突变破坏了天然表位。例如，在构建VRC4301中Nef多肽的氨基酸替代物为P69A、P72A、P75A、P78A、D174A和D175A。在这6个突变中每一个均位于实施例8中的一个特定表位，因此在修饰的Nef基因中没有保留天然表位。构建VRC4306、VRC4309、VRC4310、VRC4311、VRC4312和申请WO02/32943中的相似构建中，逆转录酶突变(D771H)存在于YMDD基序中(见表位图RT 183-186)，此基序含有许多记录表位。因此在现有技术中的构建体中没有保留这些表位。此外，通过如VRC 4312和相似构建体中所描述的截短融合，产生了申请WO02/32943中所揭示的合成的gag/pol/nef基因。参照VRC4312，合成的gag基因与编码合成nef基因的序列连接，其5’端51个氨基酸缺失；pol多聚蛋白5’端77个氨基酸缺失，然后与缺失tag终止密码子的nef的3’端连接。这些pol和nef的截短引起表位缺失，因此天然表位没有以全长gag/pol/nef基因的形式保留。申请WO02/022080(Merckand Co.)揭示了HIV1-Gag、Pol和Nef的修饰。其中描述的主要修饰是gag基因、Pol和Nef的密码子优化。没有提到Gag多肽的突变，只是编码的核苷酸密码子进行了优化。申请WO02/022080中的实施例17提出了蛋白Pol的不同突变；提出了9个点突变，其中有3个突变分别位于此蛋白的逆转录酶、RNA酶和整合酶区。至少HIV-1 Pol的突变D112A，D187A，D188A，D445A和D500A位于人的表位中，因此没有保留天然表位。至少FHV-1和IRV-1中Nef的突变‘LLAA’(例如L164A，、L165A双突变)位于人的表位中，因此在突变的Nef多肽中没有保留天然表位。申请WO03/025003揭示了不同改变的gag基因构建体，也提到了nef基因和pol的构建体。nef基因构建体是从nef的N端截短去除了表位。gag基因构建体没有被突变。本专利技术找到了解决上述讨论的一些问题的方法。专利技术概述本专利技术是基于HIV来源的CD8+T细胞表位的显著有效递呈的设计而完成。该方式能够产生最强和最广的免疫反应。本专利技术通过改变含有表位的多肽序列来实现。这样可以破坏病毒多肽的天然生物学功能，而有利于使它们安全应用于疫苗，同时谨慎地保留了现有技术已知将被破坏的天然表位。本专利技术中，将补充的(例如，非天然的)辅助T细胞表位也引入到抗原多肽中，从而更有利地增强和扩大免疫反应。因此，一方面本专利技术提供了一种重组多肽，其包含的氨基酸序列来源于下面其中至少一种(i)HIV gag基因产物；(ii)HIV基因pol产物；或者(iii)HIVnef基因产物，其中氨基酸序列与上述基因产物的天然序列相比较被突变并且基本上保留了如详述于实施例8所示的p17和p24(gag)、RT(pol)的氨基酸1-440和nef的基因产物的相应部分的全部天然CD8+T细胞表位。另一方面，本专利技术涉及一种如上面所述的重组多肽，其包含来源于(i)、(ii)和(iii)中至少两种的氨基酸序列。当多肽仅包含来源于(i)、(ii)和(iii)中两种的氨基酸序列时，优选地来源于(i)和(iii)，即gag和nef。另一方面，本专利技术涉及一种如上面所述的重组多肽，其包含来源于(i)、(ii)和(iii)的氨基酸序列。优选地，重组多肽包含的(i)、(ii)和(iii)来源的每个序列与该基因产物的天然序列相比较都产生了突变。优选每个序列基本上保留了全部天然CD8+T细胞表位，更优选的是保留了所有的所述表位。另一方面，本专利技术涉及如上面所述的一种重组多肽，其中来源于(i)和/或(ii)和/或(iii)的氨基酸序列从多肽的N端到C端以(i)-(ii)-(iii)的顺序排列。另一方面，本专利技术涉及一种重组多肽，其包含的氨基酸序列来源于(i)HIV gag基因的产物；(ii)HIV pol基因的产物；和(iii)HIV nef基因的产物，其中氨基酸序列与该基因产物的天然序列相比较被突变并且基本上保留了如详述于实施例8所示的p17和p24(gag)、RT(pol)的氨基酸1-440和nef的所述基因产物的全部天然CD8+T细胞表位，该多肽所含的氨基酸序列与SEQ ID NO9至少有75％的一致性。优选地，该多肽所含的氨基酸序列与SEQ ID NO9至少有95％的一致性。另一方面，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组多肽，其包含的氨基酸序列来源于：（ｉ）ＨＩＶｇａｇ基因产物；（ｉｉ）ＨＩＶｐｏｌ基因产物；和（ｉｉｉ）ＨＩＶｎｅｆ基因产物，其中氨基酸序列相对于所述基因产物的天然序列发生突变并且基本上保留 了如详述于实施例８的ｐ１７和ｐ２４（ｇａｇ）、ＲＴ（ｐｏｌ）的氨基酸１－４４０和ｎｅｆ的所述基因产物的全部天然ＣＤ８＋Ｔ细胞表位，该多肽包含的氨基酸序列与ＳＥＱＩＤＮＯ：９至少有７５％的一致性。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：约尔根施奈德，
申请(专利权)人：奥克森治疗有限公司，
类型：发明
国别省市：GB[英国]