重组穿孔素、其表达和用途制造技术

本发明专利技术涉及能够在细胞中驱动穿孔素表达的逆转录病毒载体和在细胞中表达重组穿孔素的方法。本发明专利技术也涉及从其衍生而来的重组穿孔素多肽和核酸分子及其用途。还包括使用该重组穿孔素分子的筛选测定法、由该筛选测定法鉴定的化合物及其用途。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及能够在细胞中驱动穿孔素表达的逆转录病毒载体和在细胞中表达重组穿孔素的方法。本专利技术也涉及从其衍生而来的重组穿孔素多肽和核酸分子及其用途。还包括使用该重组穿孔素分子的筛选测定法、由该筛选测定法鉴定的化合物及其用途。背景穿孔素，由细胞例如细胞毒性T淋巴细胞(CTL)和自然杀伤细胞(NK)分泌的膜破坏性蛋白，是通过颗粒胞吐途径而被靶向毁灭的被病毒感染或转化的细胞的死亡所必要的。许多研究已显示缺少穿孔素的动物或人受到严重的免疫抑制。例如，两个穿孔素等位基因都被靶向破坏的小鼠明显地对许多病毒和其他细胞内病原体例如单核细胞增生利斯特氏菌(Listeria monocytogenes)易感。在这些动物中也缺乏对许多实验性肿瘤的排斥，转移性扩散的可能性也常常提高。此外，超过50％的穿孔素缺乏性动物随着年龄增长产生出自发性的、高度侵袭性的B淋巴瘤，表明肿瘤免疫监视(tumour immunesurveillance)的丧失。在这些动物中产生的肿瘤可容易地移植入穿孔素缺乏性接受者中，但却被同系的(syngeneic)具有免疫能力的动物强烈排斥。在CTL中，穿孔素从具有粒酶的分泌性颗粒(granule)中释放出来，粒酶属于具有促细胞凋亡活性(pro-apoptotic activity)的丝氨酸蛋白酶家族。和穿孔素相反，在粒酶中存在相当多的功能丰余性，尽管其具有明显不同的蛋白水解特异性。例如，粒酶A和B都有缺陷的小鼠只对选择的病毒例如脱脚病病毒具有异常的敏感性，但能够排斥许多在穿孔素缺乏性小鼠中自发产生的实验性肿瘤和淋巴瘤。总之，可以猜测穿孔素是所有颗粒介导的病毒和肿瘤免疫以及免疫稳态(immune homeostasis)不可缺少的唯一颗粒组分。在人中，穿孔素缺乏的综合症状只有近年来才得以描述，因为已显示大约30％的表现罕见的常染色体隐性疾病家族性噬血细胞性淋巴组织细胞增多症(familial hemophagocytic lymphohistiocytosis)(FHL)的儿童在其两个穿孔素等位基因上都携带突变。FHL是噬血细胞性淋巴组织细胞增多症(hemophagocytic lymphohistiocytosis)(HLH)的一种亚型，所述HLH还包括各种相关的偶然发生的无已知家族基础的免疫缺陷疾病。HLH和FHL的特征一般在于被活化的T淋巴细胞和巨噬细胞(组织细胞)在肝脏、脾脏、淋巴结和中枢神经系统中的大量和逐渐积累，然后导致红细胞和其他血细胞的吞噬作用。这些儿童的细胞毒性细胞，特别是CTL，不能提供通过所述颗粒途径的对靶细胞的致命打击。因此，有缺陷的淋巴细胞不能清除抗原呈递细胞，导致巨噬细胞的不受控制的活化和积累以及炎性细胞因子的过量产生，表现为发烧，肝和脾的肿大，以及脾、肝和骨髓中的吞噬血细胞作用的临床综合症状。在组织学上，这些患者中的CTL和NK细胞一般表现出其裂解性颗粒(lytic granules)中的免疫反应性穿孔素的显著减少，这可以反映穿孔素蛋白的不稳定性，或增加的响应免疫攻击而引起的穿孔素的转化。总之，在HLH或FHL中的临床和病理学发现使人联想起病毒特异性T细胞和抗原呈递细胞的增加的扩增，以及在感染了病原体例如淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒的穿孔素缺乏性小鼠中见到的不能下调免疫应答。尽管其明显的重要性，但在分子和细胞水平上穿孔素的功能仍然很不清楚。由于纯化的穿孔素不能诱导凋亡，因此认为其关键性作用涉及将粒酶精确地靶向靶细胞的细胞溶胶中，在那里其蛋白水解活性诱导细胞的凋亡程序。粒酶B，最强的促细胞凋亡的粒酶，通过在特异的天冬氨酸残基之后切割底物(Asp-ase活性)来模拟胱天蛋白酶的活性。Bid，Bcl-2家族的促细胞凋亡的成员，是粒酶B的特别重要的底物，因为截短的Bid可通过激活内源性细胞凋亡途径而引起细胞死亡，该途径集中于线粒体瓦解。粒酶A在碱性残基之后进行切割和诱导不依赖于胱天蛋白酶的DNA链切刻(nicking)，尽管已显示小鼠粒酶C可直接破坏线粒体的功能。以高浓度单独地使用纯化的穿孔素也可诱导靶细胞裂解，并且这种形式的细胞死亡也在一些生理相关条件下发生。在分子水平上，很少了解穿孔素是如何发挥其功能的。据预测，穿孔素的羧基末端和突触结合蛋白家族的蛋白质的羧基末端非常相似，该家族的一些成员在神经元突触中参与囊泡运输(vesiculartrafficking)。一个漂亮的研究已产生了这样的证据，即在穿孔素的生物合成期间，其在靠近其羧基末端的部位被未知的蛋白酶切割，从而释放出附着有巨大的N联聚糖的短肽。预测该短肽使得可在该羧基末端结合钙和脂质，从而使穿孔素能够在CTL脱粒后插入靶细胞膜中。在发生钙依赖性构象变化后，认为残基210至245形成允许膜插入的两亲性螺旋结构，尽管还不清楚和表皮生长因子受体的富含半胱氨酸的结构域(残基375至410)相似的另一个区域的功能。对应于氨基末端的合成肽也已显示具有一些内源的裂解能力。然而，未检测该观测结果的生理学相关性。因此，虽然其在针对病毒和被转化的细胞的免疫应答中有至关重要的重要性，并且尽管在超过15年以前独立地克隆了鼠和人cDNA，但在分子和细胞水平上对穿孔素的功能仍然了解不多。该缺乏显著进展的状况主要归因于缺乏用于进一步研究目的的能够合成和贮存该毒性蛋白的细胞系。在广泛的研究学科(research disciplines)中，培养的细胞系的用途已极大地促进了对蛋白功能的研究。穿孔素的固有细胞毒性已产生了这样的特殊需要，即需要鉴定具备合适的自我保护手段以表达穿孔素而不破坏细胞器的细胞，所述蛋白在该细胞中被合成、运输和随后贮存。这样的细胞系的缺乏已成为穿孔素结构-功能研究的主要障碍。许多尝试(大多数是不成功的)涉及使用细菌表达系统来合成穿孔素。由于溶解度问题，在杆状病毒感染的昆虫细胞中进行穿孔素的表达不可靠，从而该方法未被广泛使用。因此，穿孔素分子的突变分析从未被描述过。在查看文献后，逐渐明了的是，过去少数细胞曾经成功地用于穿孔素的表达。很明显，CTL和NK细胞是能够进行穿孔素合成的理想细胞，然而很少有这样的细胞系进行过培养。淋巴细胞生物学领域内的研究人员已采取使用刚分离的淋巴细胞、培养的淋巴细胞肿瘤或通过导入癌基因而永生化的少数细胞毒性细胞系。在每种情况下，缺点是在这些细胞中存在内源穿孔素，其使穿孔素的结构/功能研究复杂化。以前已显示，人穿孔素在小鼠CTL细胞系CTLL-R8中的表达干扰内源穿孔素的功能，这导致被转染的细胞系的减少的细胞毒性。理想地，结构/功能研究要求缺乏穿孔素表达的细胞系，但在该细胞系中，可能要重新导入穿孔素(野生型或突变的)。本专利技术克服了，或至少缓解了一些现有技术的上述问题，并且这样做之后，提供了更有效和更合适的在细胞中重组地表达穿孔素或其片段或变体的方法。对于在本说明书中包含的文献、做法、材料、设备、物品等的讨论仅是为了提供本专利技术的背景。并不暗示或代表这些资料中的任何一种或全部形成现有技术基础的一部分或者是在与本专利技术相关的领域内的公知常识，因为其在本申请的每一项权利要求的优先权日之前已在澳大利亚存在。专利技术概述逆转录病毒载体，该载体能够驱动穿孔素分子或其片段或变体在用所述载体转染的宿主细胞中表达。在本专利技术的另本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种逆转录病毒载体，该载体能够在用所述载体转染的宿主细胞中驱动穿孔素分子或其片段或变体的表达。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：JA特拉帕尼，MJ史密斯，
申请(专利权)人：彼得麦克凯勒姆肿瘤研究所，
类型：发明
国别省市：AU[澳大利亚]