一种应用编码多种外源基因的慢病毒载体制备分泌胰岛素的干细胞系的方法技术

一种应用编码多种外源基因的慢病毒载体制备分泌胰岛素的干细胞系的方法。该方法选择改造的是复制缺陷型慢病毒载体ｐＷＰＳＴ；将多种胰岛素调控基因克隆至该载体，转染２９３Ｔ细胞进行包装后，收集病毒颗粒并浓缩后，转染人胚胎胰腺干细胞；本发明专利技术具有以下优点：载体构建方法简单，实用性好；转染效率高；转染后明显提高胰岛素表达水平；转染后使用细胞克隆方法筛选，可以得到表达一种、两种或同时表达三种外源基因的细胞株，并且这三类细胞株胰岛素表达水平不同，可以用于不同的需要。

【技术实现步骤摘要】

【技术保护点】
一种应用编码多种外源基因的慢病毒载体制备分泌胰岛素的干细胞系的方法，其特征在于，包括如下步骤：１）载体的构建：①根据ｐＷＰＴＳ－ＧＦＰ的序列，用ＳａｌⅠ和ＢａｍＨ１切除ＧＦＰ后，用Ｋｌｅｎｏｗ酶补平载体的两端，经碱性磷酸酶处理切除羟基，防止载体自身的环化；②分别将带ＢｓｔＢ１和ＢｇｌⅡ酶切位点的ＲＳＶｎｅｏ质粒、带有Ｘｂａｌ和Ｎｏｔｌ酶切位点的ＭａｆＡ质粒、带有ＥｃｏＲ１酶切位点的ＰＤＸ－１质粒、带有ＥｃｏＲ１和Ｘｂａｌ酶切位点的ＮｅｕｒｏＤ１质粒扩增后，用前述相应的限制性内切酶释放出目的片段，分别经Ｋｌｅｎｏｗ酶补平后与ｐＷＰＴＳ载体连接，获得携带目的基因的慢病毒载体；经前述限制性内切酶消化及ＤＮＡ序列测定以证实克隆的目的基因序列正确，从而证实重组构建慢病毒载体ｐＷＰＴＳ－Ｎｅｏｍｙｃｉｎ、ｐＷＰＴＳ－ＭａｆＡ、ｐＷＰＴＳ－ＰＤＸ－１和ｐＷＰＴＳ－ＮｅｕｒｏＤ１成功；２）慢病毒的包装：将慢病毒包装质粒ｐＭＤ２Ｇ和ｐＰＡＸ２分别转入Ｅ．ＣｏｌｉＤＨ５α菌中进行扩增后，用质粒提取纯化试剂盒制备质粒；然后在培养的２９３Ｔ细胞接近１／４～１／３汇合时，将制备好的４．５～５．５μｇ包装质粒ｐＭＤ２Ｇ和１２～１７μｇ的包装质粒ｐＰＡＸ２分别与载体质粒ｐＷＰＴＳ－ＧＦＰ、ｐＷＰＴＳ－Ｎｅｏｍｙｃｉｎ、ｐＷＰＴＳ－ＮｅｕｒｏＤ１、ｐＷＰＴＳ－ＰＤＸ－１和ｐＷＰＴＳ－ＭａｆＡ各１８～２３μｇ混合后，用含２．５毫摩尔／升Ｈｅｐｅｓ的灭菌水做为缓冲水调节到２４０～２６０μｌ，然后加入０．５摩尔／升的ＣａＣｌ↓［２］２５０μｌ，混和均匀，以４０～６０μｌ／秒的速度滴加到２×ＨｅＢＳ溶液中；然后以２５００转／分的速度振荡混合均匀前述各溶液，混合后得混合液，轻轻将混合液加到２９３Ｔ细胞表面，转染后在转染后４５～５０小时和在转染后６５～７５小时，分别收集含有不同病毒颗粒的细胞上清液，将此上清液用直径０．４５μｍ滤器过滤后，混合在一起进行浓缩，得含有Ｎｅｏｍｙｃｉｎ、ＭａｆＡ、ＰＤＸ－１和ＮｅｕｒｏＤ１基因的病毒混合悬液，在０～４℃的条件下保存备用；３）病毒滴度的测定：用含有ＧＦＰ的病毒悬液转染Ｈｅｌａ细胞，经流式细胞仪检测此含有ＧＦＰ的病毒滴度，间接反映含有Ｎｅｏｍｙｃｉｎ、ＭａｆＡ、ＰＤＸ－１和ＮｅｕｒｏＤ１基因的病毒滴度；４）转染人胚胎胰腺干细胞：从人胚胎胰腺分离出胰腺干细胞，接种在６、１２或２４孔的细胞培养板上，待细胞长至６０～８５...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：门秀丽，张文健，娄晋宁，
申请(专利权)人：中日友好医院，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]