一种检测人EGFR基因突变的液相芯片制造技术

本发明专利技术公开了一种基于条形编码磁珠的人表皮上体细胞（EGFR）突变检测试剂、方法以及引物探针，针对EGFR18、19、20、21四个外显子，设计了不同的引物探针，本发明专利技术所设计的扩增引物是基于血浆、血清游离核酸为目的片段的，扩增片段80‑350bp之间，引物之间无非特异性扩增，干扰小，能够在1个反应管内完成29种突变检测，具有特异性好、准确性高及假阳性低的特点。

A liquid phase chip for detecting the mutation of human EGFR gene

The invention discloses a human epidermal cell body strip based on magnetic bead encoding (EGFR) mutation detection reagents, methods and primers for EGFR18, 20, 19, 21, four exons, primers were designed with different probes, primers designed by the invention is blood plasma, serum free nucleic acid based on the purpose of the fragment between 80 350bp amplified fragment, primers between no nonspecific amplification, little interference, in 1 the reaction tube 29 kinds of mutation detection, has good specificity, high accuracy and low false positive characteristics.

【技术实现步骤摘要】
一种检测人EGFR基因突变的液相芯片
本专利技术属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体的是涉及一种EGFR基因突变检测基因芯片。
技术介绍
EGFR(EpidermalGrowthFactorReceptor,表皮生长因子受体简称为EGFR、ErbB-1或HER1）是表皮生长因子受体(HER)家族成员之一。该家族包括HER1(erbB1，EGFR)、HER2(erbB2，NEU)、HER3(erbB3)及HER4(erbB4)。HER家族在细胞生理过程中发挥重要的调节作用。是非小细胞肺癌（NSCLC）治疗最重要的分子靶点，是原癌基因C-erbB-1（HER-1)的表达产物，位于第7号染色体短臂上。EGFR广泛分布于哺乳动物上皮细胞、成纤维细胞、胶质细胞、角质细胞等细胞表面，EGFR信号通路对细胞的生长、增殖和分化等生理过程发挥重要的作用。研究表明在许多实体肿瘤中存在EGFR的高表达或异常表达。EGFR与肿瘤细胞的增殖、血管生成、肿瘤侵袭、转移及细胞凋亡的抑制有关。其可能机制有：EGFR的高表达引起下游信号传导的增强；突变型EGFR受体或配体表达的增加导致EGFR的持续活化；自分泌环的作用增强；受体下调机制的破坏；异常信号传导通路的激活等。EGFR的过表达在恶性肿瘤的演进中起重要作用，胶质细胞、肾癌、肺癌、前列腺癌、胰腺癌、乳腺癌等组织中都有EGFR的过表达。对胶质细胞瘤的研究发现EGFR的高表达主要与其基因扩增有关。但有时EGFR表达水平的调节异常也存在于翻译及翻译后。EGFR在肿瘤中的高表达还可能与活化后降解减少有关，一些研究指出C-Src可通过抑制受体泛素化和内吞作用而上调EGFR水平。许多肿瘤中有突变型EGFR存在，现已发现许多种EGFR突变型。突变型EGFR的作用可能包括：具有配体非依赖型受体的细胞持续活化；由于EGFR的某些结构域缺失而导致受体下调机制的破坏、异常信号传导通路的激活、细胞凋亡的抑制等。突变体的产生是由于EGFR基因的缺失、突变和重排。EGFR的配体对细胞内信号传导有很大影响。EGFR的配体通过自分泌形式激活EGFR促进细胞增殖，他们的共表达往往预示肿瘤预后不良，例如，在乳腺浸润性导管癌的研究中发现，TGFα与EGFR共表达，且这种共表达与病人的生存率显著相关。Kopp等人对结/直肠癌的研究表明肿瘤的自分泌生长是EGFR的过表达及其配体表达共同作用的结果。EGFR信号通路重要靶标的检测及靶向治疗已是肿瘤个体化医疗领域关注的焦点，目前已经开发多种EGFR靶向药物。按照作用机制，针对EGFR的靶向药物分为以下两种：1）作用于EGFR激酶区的小分子酪氨酸激酶抑制剂（EGFR-TKI）；2）作用于EGFR胞外部分的单克隆抗体，如西妥昔单抗（Cetuximab）、帕尼单抗（Vectibix）。其中EGFR-TKI在治疗非小细胞肺癌（NSCLC）临床疗效明显，已被推荐为晚期癌症患者的一线用药。临床上，易瑞沙（吉非替尼，Gefitinib）和特罗凯（厄洛替尼，Erlotinib）目前被广泛的应用到NSCLC患者的治疗，单并不是所有的病人用这两种药物就有很好的治疗效果，EFGR敏感突变是药物有效的前提。酪氨酸酶抑制剂与EGFR结合后，抑制EGFR自身磷酸化，阻断了EGFR信号通路,从而抑制肿瘤细胞增殖、分化、促进肿瘤细胞凋亡、减少肿瘤新生血管等，从而实现靶向治疗。目前，临床上对EGFR基因突变检测的方法主要有Sanger测序法、高效液相色谱法、实时荧光定量法、x-TAG基因芯片法、FISH原位杂交法。在检测时间和灵敏度方面都不太乐观，x-TAG基因芯片法为例，最少需要5个小时才能完成从样本的处理、目的片段的扩增、芯片的杂交、样本的检测；荧光PCR检测时间虽短，但难以从1个反应管内完成29种突变检测。BarcodeBeads技术是把条形芯片磁珠刻上条形编码，共价交联上针对特定检测物的探针、抗原或抗体。应用时，先把针对不同检测物的条码磁珠混合，再加入微量待检样本，在悬液中靶分子与微球表面交联的分子进行特异性地结合，在一个反应孔内可以同时完成多达数十种甚至几百种不同的生物学反应。最后用AppliedBarcode2000仪器进行分析，仪器通过高分辨显微镜和荧光显微镜识别条码磁珠和检测条码磁珠上报告分子的荧光强度实现对样本的检测。AppliedBarcodeBeads技术是基于条码磁珠为基础的液态芯片，是一个高通量、高速度以及多功能生物技术平台，它有机地整合了编码微球（codebeads）、荧光技术、免疫杂交、DNA杂交、最新的高速数字信号处理器和计算机运算法则，造就了其无与伦比的检测特异性和灵敏度，可广泛应用于免疫分析、核酸研究、酶学分析、受体和配体识别分析等研究，得到各权威机构和医学界高度认可，是临床诊断领域以及生命科学研究中的一大热点。迄今发现与肿瘤个性化用药相关的基因突变点位主要集中在EGFR外显子18、19、20、21，这些突变根据用药可以分为两类：1）抗药突变，2）敏感性突变。其中外显子18、19、21点位的突变可以增强药物的药效，而20号外显子的突变主要集中在药物治疗的复发者，突变使得癌细胞对TKI类药物产生拮抗。外显子18、19、20、21主要已以下类型突变，具体突变位点如下表所示：
技术实现思路
本专利技术提供一种新的检测平台——BarcodeBeads液体芯片法。在此平台上专利技术了一种用于检测人表皮细胞受体（EGFR）基因突变检测试剂及检测方法，该检测试剂可以在一个反应测试管中检测EGFR外显子18、19、20、21中29种突变类型。实现上述目的的技术方案如下：一种用于检测人表皮细胞受体（EGFR）基因突变检测试剂，主要包括有：使用检测外显子18突变的磁珠选自BMBIDNO.1～10,检测外显子19突变的磁珠选自BMBIDNO.11～40，检测外显子20突变的磁珠选自BMBIDNO.41～51，检测外显子21突变的磁珠选自BMBIDNO.52～60.针对EGFR扩增外显子18、19、20、21野生型和突变型设计的引物及探针，野生型和突变型设计探针的5’有NH2修饰。本专利技术同时提供了检测外显子18时扩增的引物序列选自SEQ.ID.NO.1～4中一种以上序列，检测外显子19时扩增的引物选自序列SEQ.ID.NO.17～20中一种以上序列,检测外显子20时扩增的引物选自序列SEQ.ID.NO.81～84中一种以上序列,检测外显子21时扩增的引物选自序列SEQ.ID.NO.115～118中一种以上序列。本专利技术提供了用于检测突变位点的特异性探针，检测外显子18上的突变位点的探针序列来源于SEQ.ID.NO.5～16中一种以上序列,检测外显子19上的突变位点的探针序列来源于SEQ.ID.NO.21～80中一种以上序列,检测外显子20上的突变位点的探针序列来源于SEQ.ID.NO.81～114中一种以上序列,检测外显子21上的突变位点的探针序列来源于SEQ.ID.NO.119～130中一种以上序列。以上特异性探针序列的3’端的最后1～6个碱基中的一个或几个为突变碱基，上述所有的特异性引物的TM值60～66之间。本专利技术提供了一种对点突变检测的方法，本方法不用杂交，而是对突变位点进行PCR扩增本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于人EGFR突变检测的条形码磁珠，其特征包括： (1)条形码磁珠的尺寸70umx30umx5 um ，码磁珠不带任何核苷酸序列，PCR扩增时条码磁珠之间无任何反应和干扰，可以实现在一个反应孔内对多个项目的检测； (2) 包被探针的微球来源于BMB ID NO.1～60任意一种，使用检测外显子18突变的磁珠选自 BMB ID NO.1～10,检测外显子19突变的磁珠选自BMB ID NO.11～40，检测外显子20突变的磁珠选自BMB ID NO.41～51，检测外显子21突变的磁珠选自BMB ID NO.52～60.针对EGFR扩增外显子18、19、20、21野生型和突变型设计的引物及探针，野生型和突变型设计探针的5’有NH2修饰。

【技术特征摘要】
1.用于人EGFR突变检测的条形码磁珠，其特征包括：(1)条形码磁珠的尺寸70umx30umx5um，码磁珠不带任何核苷酸序列，PCR扩增时条码磁珠之间无任何反应和干扰，可以实现在一个反应孔内对多个项目的检测；(2)包被探针的微球来源于BMBIDNO.1～60任意一种，使用检测外显子18突变的磁珠选自BMBIDNO.1～10,检测外显子19突变的磁珠选自BMBIDNO.11～40，检测外显子20突变的磁珠选自BMBIDNO.41～51，检测外显子21突变的磁珠选自BMBIDNO.52～60.针对EGFR扩增外显子18、19、20、21野生型和突变型设计的引物及探针，野生型和突变型设计探针的5’有NH2修饰。2.用于人EGFR突变检测的扩增引物序列，其特征在于：检测外显子18时扩增的引物序列选自SEQ.ID.NO.1～4中一种以上序列，检测外显子19时扩增的引物选自序列SEQ.ID.NO.17～20中一种以上序列,检测外显子20时扩增的引物选自序列SEQ.ID.NO.81～84中一种以上序列,检测外显子21时扩增的引物选自序列SEQ.ID.NO.115～118中一种以上序列。3.根据权利2所述，扩增EGFRexon18序列的引物来源于SEQ.ID.NO.1～4其中的2条或4条，扩增EGFRexon19序列的引物来源于SEQ.ID.NO.17～20其中的2条或4条，扩增EGFRexon20序列的引物来源于SEQ.ID.NO.81～84其中的2条或4条，扩增EGFRexon21序列的引物来源于SEQ.ID.NO.115～118其中的2条或4条。4.用于人EGFR突变检测的探针序列，其特征在于：检测外显子18上的突变位点的探针序列来源于SEQ.ID.NO.5～16中一种以上序列,检测外显子19上的突变位点的探针序列来源于SEQ.ID.NO.21～80中一种以上序列,检测外显子20上的突变位点的探针序列来源于SEQ.ID.NO.81～114中一种以上序列,检测外显子21上的突变位点的探针序列来源于SEQ.ID.NO.119～130中一种以上序列；以上特异性探针序列的3’端的最后1～6个碱基中的一个或几个为突变碱基，上述所有的特异性引物的TM值60～66之间。5.根据权利4要求，检测人EGFR突变的探针序列设计，其特异性从3’端的-2位碱基位错配碱基。6.根据权利4和5要求，扩增EGFRexon18点突变G719A\G719S\G719C的探针序列来源于SEQ.ID.NO.8～16，扩增EGFRexon18野生型的探针序列来源于SEQ.ID.NO.5～7；扩增EGFRexon19缺失突变E746-A750del(1)\E746-A750del(2)\L747-P753>S\E746-A750>I\E746-A750del\E746-A750>A\E746-S752>A\E746-S752>V\E746-S752>D\L747-A750>P\L747-T751>Q\L747-E749del\L747-T751del\L747-S752del\L747-A750>P\L747-P753>Q\L747-T751>S\L747-T751del\L747-T751>P的探针序列来源于SEQ.ID.NO.24～80，扩增EGFRexon19野生型的探针序列来源于SEQ.ID.NO.21～23；扩增EGFRexon20点突变T790M的探针序列来源SEQ.ID.NO.100～102...

【专利技术属性】
技术研发人员：姬宏超，胡东雄，万艳娟，
申请(专利权)人：广州赛百纯生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44