用于诊断膀胱癌的方法技术

提供了用于基于在选择的基因组基因座处DNA甲基化的改变鉴定受试者中的膀胱癌的方法和试剂盒。

A method for the diagnosis of bladder cancer

Methods and kits for identification of bladder cancer in subjects based on changes in DNA methylation at selected genomic loci are provided.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于诊断膀胱癌的方法专利
本专利技术涉及用于通过分析源自受试者的生物样品鉴定所述受试者中的膀胱癌的方法。更具体地，本专利技术涉及通过分析来自尿样品的DNA鉴定膀胱癌。该方法基于正常和膀胱癌DNA之间DNA甲基化的差异。专利技术背景膀胱癌是由膀胱中的细胞引起的癌症。大多数膀胱癌是由膀胱内衬中的上皮细胞(尿路上皮)引起的移行细胞癌。其他类型的膀胱癌包括鳞状细胞癌、腺癌、肉瘤和小细胞癌。膀胱癌的诊断通常通过膀胱镜检查进行，在膀胱镜检查中使用内窥镜(膀胱镜)对膀胱可视地检查。活组织检查物通常取自疑似异常的区域，来检查任何癌性细胞的存在。膀胱癌的诊断中采用的另一种方法是尿细胞学，其中在显微镜下分析尿样品以检测癌细胞的存在。多种成像方法诸如X-射线和计算机断层扫描(CT)已经被采用，用于诊断膀胱癌，该多种成像方法中的一些涉及静脉注射染料，以使得检查的组织能够可视化。在最近几年，用于膀胱癌的另外的诊断手段已变得可用，诸如尿抗原测试和用于检测尿样品中的染色体异常的测定(UroVysionTM)。目前可用的方法具有很多缺点，因为它们中的一些是侵入性的、费力且耗时的，并且一些方法不够灵敏和特异。另外，通过病理学检查的诊断人工地进行并且因此是主观的。主观结果是有问题的，因为在由不同病理学家并且甚至由相同病理学家在不同时间分析的相同样品的结果之间可以存在差异。属于本专利技术的申请人的WO2011/001274和WO2011/070441，分别公开了基于特定基因组基因座之间的信号比率的鉴定来自天然来源的DNA的方法，以及将DNA样品分类成不同类型的组织的方法。对于用于以高特异性和高灵敏度诊断有相应需要的受试者中的膀胱癌而不要求良好训练的病理学家的改进的方法和试剂盒存在未被满足的需要。对客观、不依赖使用者的诊断方法也存在需要。专利技术概述根据一些方面，本专利技术提供了用于通过分析来自尿样品的DNA鉴定有相应需要的受试者中的膀胱癌的方法和试剂盒。本专利技术的方法和试剂盒基于在正常DNA和膀胱癌DNA之间在选择的基因组基因座处的甲基化差异。更具体地，本专利技术的方法和试剂盒利用一组基因组基因座，该组基因组基因座被出乎意料地发现在源自膀胱癌的DNA中被高度甲基化并且在源自健康膀胱组织的DNA中未被高度甲基化，并且从而可以用于确定给定的DNA样品是来自膀胱癌患者还是来自健康受试者。出乎意料地，本专利技术的方法和试剂盒显示出与细胞学相比具有较高的灵敏度，具有至少90％的总灵敏度(不区分膀胱癌级别或阶段)，在侵袭性肿瘤中100％的灵敏度以及在非侵袭性肿瘤中至少89％的灵敏度。根据本专利技术的方法和试剂盒，用至少一种甲基化敏感性限制性酶消化来自测试的受试者的尿样品的DNA，只有在DNA未被甲基化时该甲基化敏感性限制性酶才裂解其识别序列。本文公开的被称为“限制性基因座”的基因组基因座的组包括至少一种甲基化敏感性限制性酶的识别序列，并且因此根据其甲基化水平而被切割(消化)，其中较高程度的甲基化导致较少的酶消化。出乎意料地，来自健康个体的DNA样品在本文公开的基因组基因座的组处比来自癌症患者的DNA样品更彻底地被切割。因此，在其中本专利技术的限制性基因座被高度甲基化的DNA样品和其中这些基因座具有低甲基化水平的DNA样品之间消化效率的差异，在随后的扩增步骤和定量步骤中确立了不同的扩增模式。出乎意料地，扩增模式的差异允许区分来自膀胱癌组织的DNA和来自正常膀胱组织的DNA。根据本专利技术的方法和试剂盒的扩增和定量步骤包括共扩增来自被消化的DNA的至少一种限制性基因座和对照基因座。对照基因座可以是不被消化步骤中使用的甲基化敏感性限制性酶切割的基因座。然后确定扩增的基因座的信号强度并计算每个限制性基因座和对照基因座的信号强度之间的比率。现在第一次公开了针对膀胱癌DNA和正常膀胱DNA产生区别性信号比率，因此使得能够鉴定膀胱癌。通过将计算的来自测试的受试者的DNA的信号比率与确定的已知来源即正常个体和/或癌症患者中的相同限制性基因座的一种或更多种参考比率比较，来进行膀胱癌的鉴定。基于该比较，将测试的样品鉴定为源自癌症患者或源自健康受试者。应注意的是，在任何时候，本专利技术的试剂盒和方法需要确定个体基因座本身的甲基化水平。本专利技术的方法和试剂盒使得能够通过测试尿样品鉴定膀胱癌，从而有利地提供了疾病的非侵入性、基于分子的诊断。请求保护的方法和试剂盒的另一种益处是，可以在尿样品中进行鉴定，尽管尿样品可包含的DNA的量相对低。通过本文公开的方法和试剂盒诊断膀胱癌所赋予的另外的益处是诊断的高灵敏度和特异性。另外，本文描述的方法产生了不依赖使用者的客观结果。根据一个方面，本专利技术提供了一种用于鉴定人受试者中的膀胱癌的方法，该方法包括：(a)将来自从受试者获得的尿样品的DNA应用于通过至少一种甲基化敏感性限制性内切核酸酶的消化，以获得限制性内切核酸酶处理的DNA；(b)从限制性内切核酸酶处理的DNA共扩增包含SEQIDNO:1中列出的基因座的至少一种限制性基因座，以及对照基因座，从而生成每种基因座的扩增产物；(c)确定每种生成的扩增产物的信号强度；(d)计算所述至少一种限制性基因座的每一种和对照基因座的扩增产物的信号强度之间的比率；以及(e)检测所述比率相对于相应的膀胱癌参考比率的高概率评分，从而鉴定人受试者中的膀胱癌。在一些实施方案中，检测所述比率相对于相应的膀胱癌参考比率的高概率评分包括检测高于预先定义的阈值的相对于膀胱癌参考比率的概率评分。在一些实施方案中，至少一种限制性基因座还包括SEQIDNO:5中列出的基因座，并且所述概率评分为SEQIDNO:1的比率和SEQIDNO:5的比率相对于它们相应的膀胱癌参考比率的组合概率评分。在一些实施方案中，至少一种限制性基因座还包括SEQIDNO:7中列出的基因座和SEQIDNO:11中列出的基因座，并且所述概率评分为所述SEQIDNO:1的比率、所述SEQIDNO:5的比率、SEQIDNO:7的比率和SEQIDNO:11的比率相对于它们相应的膀胱癌参考比率的组合概率评分。在一些实施方案中，至少一种限制性基因座还包括选自SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14和SEQIDNO:15中列出的基因座的组的至少一种另外的限制性基因座，并且所述概率评分为所述SEQIDNO:1的比率、SEQIDNO:5的比率、SEQIDNO:7的比率和SEQIDNO:11的比率以及所述至少一种另外的限制性基因座的至少一种另外的比率相对于它们相应的膀胱癌参考比率的组合概率评分。在一些实施方案中，至少一种另外的限制性基因座包括SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14和SEQIDNO:15中列出的所有基因座。因此，在一些实施方案中，至少一种限制性基因座包括SEQIDNO:1-15中列出的所有基因座。每种可能性代表本专利技术的单独实施方案。在一些实施方案中，该方法还包括：提本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于鉴定人受试者中的膀胱癌的方法，所述方法包括：(a)将来自从所述受试者获得的尿样品的DNA应用于用至少一种甲基化敏感性限制性内切核酸酶的消化，以获得限制性内切核酸酶处理的DNA；(b)从所述限制性内切核酸酶处理的DNA共扩增包含SEQ ID NO:1中列出的基因座的至少一种限制性基因座和对照基因座，从而生成每种基因座的扩增产物；(c)计算所述至少一种限制性基因座的每一种和所述对照基因座的扩增产物的信号强度之间的比率；以及(d)检测所述比率相对于相应的膀胱癌参考比率的高概率评分，从而鉴定所述人受试者中的膀胱癌。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.07.06 US 14/792,2701.一种用于鉴定人受试者中的膀胱癌的方法，所述方法包括：(a)将来自从所述受试者获得的尿样品的DNA应用于用至少一种甲基化敏感性限制性内切核酸酶的消化，以获得限制性内切核酸酶处理的DNA；(b)从所述限制性内切核酸酶处理的DNA共扩增包含SEQIDNO:1中列出的基因座的至少一种限制性基因座和对照基因座，从而生成每种基因座的扩增产物；(c)计算所述至少一种限制性基因座的每一种和所述对照基因座的扩增产物的信号强度之间的比率；以及(d)检测所述比率相对于相应的膀胱癌参考比率的高概率评分，从而鉴定所述人受试者中的膀胱癌。2.如权利要求1所述的方法，其中所述至少一种限制性基因座还包含SEQIDNO:5中列出的基因座，并且其中所述高概率评分为SEQIDNO:1的比率和SEQIDNO:5的比率相对于它们相应的膀胱癌参考比率的高组合概率评分。3.如权利要求2所述的方法，其中所述至少一种限制性基因座还包含SEQIDNO:7中列出的基因座和SEQIDNO:11中列出的基因座，并且其中所述高概率评分为所述SEQIDNO:1的比率、所述SEQIDNO:5的比率、SEQIDNO:7的比率和SEQIDNO:11的比率相对于它们相应的膀胱癌参考比率的高组合概率评分。4.如权利要求3所述的方法，其中所述至少一种限制性基因座还包含选自SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14和SEQIDNO:15中列出的基因座的组的至少一种另外的限制性基因座，其中所述高概率评分为所述SEQIDNO:1的比率、所述SEQIDNO:5的比率、所述SEQIDNO:7的比率和所述SEQIDNO:11的比率以及所述至少一种另外的限制性基因座的至少一种另外的比率相对于它们相应的膀胱癌参考比率的高组合概率评分。5.如权利要求4所述的方法，其中所述至少一种另外的限制性基因座包括SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14和SEQIDNO:15中列出的基因座。6.如权利要求1所述的方法，所述方法还包括：提供第一对照构建体和第二对照构建体，所述第一对照构建体和所述第二对照构建体包含非人DNA序列，其中所述第一对照构建体包含缺乏所述甲基化敏感性限制性内切核酸酶的识别序列的DNA序列，并且所述第二对照构建体包含含有所述甲基化敏感性限制性内切核酸酶的识别序列并且完全未被甲基化的DNA序列；用所述甲基化敏感性限制性内切核酸酶消化所述第一对照构建体和所述第二对照构建体；以及扩增所述第一对照构建体和所述第二对照构建体；其中所述第一构建体的充分扩增伴随所述第二构建体的低扩增或不扩增的检测结果指示适当的DNA消化。7.如权利要求1所述的方法，其中所述至少一种甲基化敏感性限制性内切核酸酶选自由以下组成的组：AatII、Acc65I、AccI、Acil、ACII、Afel、Agel、Apal、ApaLI、AscI、AsiSI、Aval...

【专利技术属性】
技术研发人员：丹尼·弗鲁姆金，亚当·瓦瑟斯特罗姆，
申请(专利权)人：纽克莱克斯有限公司，
类型：发明
国别省市：以色列,IL