胶质瘤预后标志物circ7:66286511|66286709及应用制造技术

本发明专利技术公开了一种胶质瘤预后标志物circ7:66286511|66286709及应用，即检测脑组织来源的circRNA circ7:66286511|66286709的试剂用于制备胶质瘤患者的预后制剂。研究者发现circRNA circ7:66286511|66286709在胶质瘤患者脑组织中表达水平显著下调(P<0.0001)，胶质瘤中circRNA circ7:66286511|66286709表达量较高的患者，拥有更高的术后生存率(P＝0.005)。因而本发明专利技术可通过检测胶质瘤患者胶质瘤组织中circRNA circ7:66286511|66286709的表达水平，从而判断胶质瘤患者的预后情况。

【技术实现步骤摘要】
胶质瘤预后标志物circ7:66286511|66286709及应用
本专利技术属于生物
，涉及一种用于胶质瘤预后的circRNA标志物、以及检测该标志物的试剂用于制备胶质瘤预后制剂的应用、还有试剂盒。
技术介绍
脑胶质瘤是颅内最常见的恶性神经上皮细胞肿瘤，占颅内肿瘤的40.49％，是成人最常见的脑部肿瘤之一。从确诊开始，脑胶质瘤患者平均生存寿命不超过五年。目前胶质瘤的治疗技术多样，但由于肿瘤浸润侵袭速度快，以及对放化疗介导的细胞凋亡不敏感等特性，总体治疗效果不佳，复发率高，预后差，因此寻找新的治疗靶点和预后指标至关重要。目前胶质瘤诊断仍然处于以临床、病理学和影像学信息为基础的经验性阶段，而且一经诊断，绝大多数均为中晚期，术后生存率不容乐观。因此，寻找新的胶质瘤预后标志物对患者进行生存分析，以提高胶质瘤患者的术后生活质量，并相应地选择合理的后续治疗方案，提高生存率，是神经科学领域亟待解决研究任务。circRNA是一类不同于线性RNA，广泛且多样地存在于哺乳动物细胞中的内源性封闭环状非编码RNA分子，其结构稳定，不易受RNA外切酶影响，能在转录，转录后，翻译等水平多层次调控基因表达，广泛存在于各类细胞中，脑部丰度极高。circRNA近年来已成为非编码RNA领域的新热点。随着深度测序技术的广泛应用和生物物理和信息学技术的快速发展，人们发现人类许多外显子的转录本可被非线性地反向剪接或通过基因重排而形成circRNA，且它们在所有剪接转录本中占了相当大的比例，并具有丰富性、稳定性、高保守性和时空特异性等特征，有作为诸多疾病分子标志物的潜力。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的是：提供一种用于胶质瘤患者预后的脑组织来源的CircRNA标志物circ7:66286511|66286709，其序列如SEQNO:1所示。本专利技术的第二个目的是，提供检测所述的CircRNA标志物在脑组织中表达量的试剂在制备胶质瘤预后制剂中的应用。本专利技术的第三个目的是，提供一种胶质瘤预后试剂盒，能够测定脑组织中的circ7:66286511|66286709的含量。所述的胶质瘤预后试剂盒，含有检测circ7:66286511|66286709含量的PCR引物。优选引物的序列如SEQNO:2和3所示。所述的胶质瘤预后试剂盒，除circ7:66286511|66286709的引物外，还含有从脑组织中提取RNA并进行逆转录及荧光定量PCR的所有试剂。包括：(1)从胶质瘤组织中抽提总RNA所用试剂，包括RNA稳定溶液、Trizol试剂、三氯甲烷、异丙醇、无酶水；(2)以总RNA为模板将circ7:66286511|66286709逆转录为cDNA所用试剂，包括逆转录缓冲液、三磷酸碱基脱氧核苷酸、RNA酶抑制剂、MMLV逆转录酶以及circ7:66286511|66286709所用随机引物；(3)将cDNA实时定量PCR所用试剂，包括circRNAcirc7:66286511|66286709实时荧光定量PCR特异性引物、GAPDH内参特异性PCR引物、实时荧光定量SYBR染料、无酶水。申请人通过对40例胶质瘤患者瘤组织及15例正常人体脑组织荧光定量PCR发现circ7:66286511|66286709在两者中明显差异表达(P&lt;0.0001)。并对接受随访的18例患者进行生存曲线分析发现胶质瘤组织来源的circRNAcirc7:66286511|66286709与患者的生存率相关，其含量越高，生存率越高(P＝0.005)。此法为胶质瘤的预后分析提供了强有力的技术支持，有助于提高胶质瘤患者的术后生活质量，制订术后治疗方案，提高生存率，具有深远的临床意义和推广性。附图说明图1为实时荧光定量PCR分析circ7:66286511|66286709在正常脑组织与胶质瘤中的表达差异；图2为生存曲线分析胶质瘤组织来源的circ7:66286511|66286709表达高低对胶质瘤患者的预后影响。具体实施方式以下结合实施例旨在进一步说明本专利技术，而非限制本专利技术。实施例1制备检测circRNAcirc7:66286511|66286709表达量的试剂用于制备胶质瘤患者预后的试剂盒(50次反应)1.RNA稳定溶液50ml2.异丙醇100ml3.三氯甲烷100ml4.Trizol50ml5.无酶水10ml6.1μM随机逆转录引物50μl7.5×逆转录缓冲液200ml8.10mM三磷酸碱基脱氧核苷酸100μl9.40U/μlRNA酶抑制剂500μl10.200U/μlMMLV逆转录酶50μl11.PremixExTaq50μl12.10μMcircRNAcirc7:66286511|66286709实时荧光定量PCR特异性引物30μlcircRNAcirc7:66286511|66286709正向引物：5'-CAGTGATTGCTCCTATGC-3'，circRNAcirc7:66286511|66286709反向引物：5'-CTGGCTTGATTACTTGGT-3'；13.10μMGAPDH特异性引物30μl正向引物为5’-ATCATCAGCAATGCCTCCT-3’，反向引物为5’-CATCACGCCACAGTTTCC-3’。实施例2组织样本circRNAcirc7:66286511|66286709的检测1、收集待测胶质瘤组织放入盛有RNA稳定溶液的冻存管中，放至-80℃冰箱备用。由实验员每天定时记录冰箱温度。2、组织中RNA的抽提：取适量标本于经180℃烘烤6-8h后的研钵中加入液氮研磨标本，研磨至粉末状后于研钵中加入1mlTrizol研钵标本，研磨成液体状后用移至tube管，于冰上静止裂解15分钟。裂解结束后4℃，12000rpm离心10min，上清液移至新的tube管。加氯仿200μl/mlTrizol于Tube中，用手震荡15-30s，冰上放置5min，4℃12000rpm离心15min；小心取上层水相入新tube中，加入预冷的异丙醇0.5ml/mlTrizol混匀，-20℃冰箱静置20min，4℃12000rpm离心10min；弃上清，加入75％DEPC水稀释的乙醇1-2ml混匀，4℃7500rpm离心5min，尽量弃上清，室温干燥5-10min，加入DEPC水10-20μl溶解RNA。-80℃保存。由实验员每天记录温度。3、circRNAcirc7:66286511|66286709逆转录：使用Thermo公司的逆转录试剂盒。20μL逆转录反应的体系如下：成分剂量/管随机逆转录引物(1μM)1μlRNA样本2μl无酶水To12μl逆转录第一步条件：65℃5分钟成分剂量/管5×逆转录缓冲液4μl三磷酸碱基脱氧核苷酸(10mM)2μlRNA酶抑制剂(40U/μl)1μlMMLV逆转录酶(200U/μl)1μl第一步PCR的产物12μl总体积20μl逆转录第二步程序：25℃5分钟，42℃60分钟，70℃5分钟。4、汉恒生物科技有限公司合成的circ7:66286511|66286709特异性引物进行实时定量PCR：先将逆转录产物稀释10倍，混匀。20μL反应体系如下：qRT-PCR的特异性引物：正向引物：5'-CAGTGATTGCTC本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于胶质瘤预后的脑组织来源的CircRNA标志物circ7:66286511|66286709，其序列如SEQ NO:1所示。

【技术特征摘要】
1.一种用于胶质瘤预后的脑组织来源的CircRNA标志物circ7:66286511|66286709，其序列如SEQNO:1所示。2.检测权利要求1所述的CircRNA标志物在脑组织中表达量的试剂在制备胶质瘤预后制剂中的应用。3.一种胶质瘤预后试剂盒，其特征在于，能够测定脑组织中的circ7:66286511|66286709的含量。4.根据权利要求3所述的胶质瘤预...

【专利技术属性】
技术研发人员：汤颖，武明花，李沛瑶，刘庆，袁健，赵春花，刘洋，
申请(专利权)人：中南大学湘雅医院，
类型：发明
国别省市：湖南,43