本发明专利技术公开了一个来源于乌拉尔甘草的查尔酮合成酶及其编码基因。实验证明，本发明专利技术的甘草查尔酮合成酶基因转化到甘草毛状根中后，查尔酮合成酶基因表达增强，相应的甘草毛状根中总黄酮含量较没有转化的毛状根最高可以提高２．５倍左右。查耳酮合成酶是植物体内黄酮类化合物代谢途径中的第一个关键酶，本发明专利技术提供的甘草查尔酮合成酶基因为基因工程改良植物体内黄酮类化合物的合成提供了一种有效的技术手段，具有广泛的应用前景和极大的经济价值，特别是可使甘草在医药、保健品、食品及化妆品领域得到更广泛的应用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及査尔酮合成酶及其基因与应用，具体涉及到乌拉尔甘草(G/yc^r/^a "ra/e朋^F^c/z)中一个査尔酮合成酶基因及其在提高植物总黄酮含量中的应用，属于植物 分子生物学领域。
技术介绍
黄酮类化合物在植物界分布很广，在植物体内大部分与糖结合成苷类或碳糖基的形式 存在，也有以游离形式存在的。天然黄酮类化合物母核上常含有轻基、甲氧基、烃氧基、 异戊烯氧基等取代基。由于这些助色团的存在，使该类化合物多显黄色。黄酮类化合物具有广泛重要的生理功能，是许多中草药的主要有效成分，普遍被应用 于临床治疗和以黄酮类化合物为功能因子的保健食品中。在药学方面，目前已经有不少以 黄酮类化合物起主要作用的中草药制剂，如安宫宁胶囊、双黄连注射液、雪莲注射液、银 杏口服液等。也有黄酮类的提取物单独使用或添加到其他药物中发挥作用。如大豆提取物 染料木黄酮对前列腺癌的多个细胞系具有明确的抑制作用；沙棘黄酮口服液能降低高脂而 且症患者的总胆固醇、甘油三醇，极高密度脂蛋白含量，对高脂血症患者的临床总有效率 为90%;橙皮(二氢黄酮苷)具有和芦丁相同的用途，也有维生素P样功效，是治疗冠心病 药物"脉通"的重要原料之一；杜鹃素(二氢黄酮)是祛痰成分，临床用于治疗慢性支气管 炎。在食品方面，黄酮类化合物可应用于食品中以增加其保健作用。 一种是将富含黄酮类 的原料直接加工成食品，如以富含黄酮类物质的植物叶部为原料，采用一般茶叶的炒制加 工方法，制作出来的冲泡型叶茶银杏茶、柿叶茶、核桃茶叶、桑叶茶等；或以黄酮类化 合物来源的植物为原料制成液体饮料复方沙棘饮料、黑米饮料。另一种是先从原料中提 取出黄酮类物质，再把它添加到其它原料中进行加工制成产品。如银杏叶黄酮芒果汁保健 饮料、灵芝杏叶保健饮料、二绿天然保健饮料、山碴酮酒等。甘草是我国重要的传统中药，具有清热解毒、润肺祛痰、缓急止痛、补气益脾胃、调和 诸药等功效，被誉为"众药之王"。甘草的主要有效次生代谢产物包括三萜类甘草酸和甘草 黄酮，甘草黄酮具有抗氧化、抗肿瘤、抗炎、抗溃疡、抗衰老、保肝等药理作用，是一类天 然抗菌剂和防腐剂。然而甘草野生资源的濒临灭绝阻碍了甘草的深入开发利用。随着生物工程技术的不断提高，利用毛状根培养来生产次生代谢产物成为研究热点，其生长迅速，分支多，不需要外源激素，而且比细胞培养容易放大，是药用植物资源可持 续发展的有效途径之一。但是甘草毛状根培养系统仍然存在活性成分低的问题，影响了甘 草毛状根的进一步发展放大和工业化。如张荫麟等(甘草的发状根培养，中草药，19卯， 21 (12): 23—26)报道乌拉尔甘草毛状根的总黄酮含量为干重的0.39%，远远低于生药根 的含量2.38%;杜旻等(甘草毛状根培养系统的建立及化学成分分析，植物资源与环境学 报，2001， 10 (1) 7-10)研究的乌拉尔甘草毛状根黄酮含量也约为0.39%;王裔惟等(光 果甘草毛状根培养过程中对活性氧清除能力和总黄酮含量的变化，植物资源与环境学报， 2004， 13(2): 6-9)检测光果甘草毛状根在生长31(1后总黄酮达到最高含量为0.78%;杨世 海等(甘草Ri质粒转化及不同理化因子对甘草毛状根生长的影响，中国中药杂志，2006, 131 (11) : 875-878)检测了乌拉尔甘草毛状根中各种不同黄酮的含量，其总黄酮的含量 约为O. 15%。甘草黄酮类化合物为次生代谢产物总黄酮的混合物，整个代谢途径十分复杂(Stefan M., Axel M.(2005), Flavones and flavone synthases. Phytochemistry, 66: 2399-2407.) 。 ^^而在]t匕生 物合成途径中，其下游的各种类型黄酮均来源于上游的同一骨架，即查耳酮。l分子4一香 显酰-CoA和3分子丙二酰-CoA在查耳酮合酶(CHS)催化下产生査耳酮(苯基苯乙烯酮)。 因此，查耳酮合酶是将苯丙垸类代谢途径引向黄酮类合成的第一个酶。査耳酮形成后经异 构化反应转变成黄烷酮(Flavanone)，再经过不同的催化反应和修饰产生不同类型的黄酮 类化合物包括黄酮(Flavone)、异黄酮(Isoflavone)、黄酮醇(Flavonol)、花青素 (Anthocyanidin) (J B Harborne H Baxter The Handbook of Natural Flavonoids John Wiley&Sons Chichester, 1999〃 P)等，因此查耳酮骨架的形成决定了其下游各种黄酮类化合 物的合成，是一个极其重要的限速步骤。也因此査耳酮合成酶(CHS)是整个代谢过程中 最重要的关键酶。随着现代分子生物学的飞速发展，应用基因工程技术，分离克隆次生代谢产物生物合 成途径中关键酶基因，并将其转化到目的植物基因组中，达到提高植物中次生代谢活性成 分已被证明是一条十分有效的途径。Seo等人(Seo JW, Jeong JH, Shin CG, et al.( 2005)， Overexpression of squalene synthase in Eleutherococcus senticosus increases phytosterol and triterpene accumulation. Phytochemistry. 66(8):869)把来自人参的鲨烯合成酶(squalene synthase, SS)以农杆菌介导转入剌五加中，结果表明该酶的活性比对照增强了3倍，其下 游产物植物甾醇类和三萜皂苷类的水平提高了2-2.5倍。2006年，Lunkenbein等将35S启动子 驱动反义查耳酮合成酶基因导入草莓，获得的25个转基因株系中，9个株系CHS mRNA积累比未转化植株减少50%以上，以查耳酮为前体的花青素、黄酮醇、原花青素的积累减少 (Lunkenbein S, Coiner H, de Vos CH, Schaart JQ Boone MJ, Krens FA, Schwab W， Salentijn EM. ( 2006 )， Molecular characterization of a stable antisense chalcone synthase phenotype in strawberry (Fmgariaxananassa). J Agric Food Chem.54(6):2145-53)。反义转化结果表明，査 耳酮合成酶调控下游黄酮类化合物的合成，是关键酶。在甘草中，査尔酮合成酶基因的克 隆还没有见到报道。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的是提供一个甘草查尔酮合成酶及其编码基因。 本专利技术所提供的査尔酮合成酶，来源于乌拉尔甘草(Gi[ycy/T/^" wra/ea^ F/"/z)，是 下述蛋白质(i)或(ii):(i) 具有序列表中的SEQIDNO: 1的氨基酸序列；(ii) 在(i)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一至十个氨基酸残基且具有相同 功能的由(i)衍生的蛋白质。序列表中的SEQ ID NO: 1氨基酸序列由389个氨基酸残基组成，将具有该氨基酸序 列的蛋白命名为CHS7G;所述本文档来自技高网...
【技术保护点】
如下蛋白质（ｉ）或（ｉｉ）： （ｉ）具有序列表中ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１的氨基酸序列； （ｉｉ）在（ｉ）限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一至十个氨基酸残基且具有查尔酮合成酶活性的由（ｉ）衍生的蛋白质。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：周骅，刘敬梅，张海超，夏勉，李毅，
申请(专利权)人：北京未名凯拓农业生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]
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