一种应用转肽酶Sortase A修饰蛋白的方法技术

本发明专利技术公开了一种应用转肽酶Sortase A修饰蛋白的方法，属于基因工程领域。本发明专利技术利用可以特异性吸附转肽酶Sortase A的磁珠，将Sortase A一步固定至磁珠上，用于催化蛋白或短肽连接、修饰反应。利用制备的Sortase A结合磁珠直接催化短肽与短肽之间的转肽连接反应、蛋白与Biotin、蛋白与树脂、短肽与蛋白之间的转肽连接反应等，相比游离酶，SortaseA结合磁珠后可至少循环使用5次，且维持大于游离酶催化效率的产率。

A method for applying the Sortase A modified protein of the peptidase

【技术实现步骤摘要】
一种应用转肽酶SortaseA修饰蛋白的方法
本专利技术涉及一种应用转肽酶SortaseA修饰蛋白的方法，属于基因工程领域。
技术介绍
SortaseA是一类介导革兰氏阳性菌细胞壁锚定蛋白与细胞壁共价结合的转肽酶，近些年其在生物
的应用吸引了越来越多的关注。自从2004年首次报道应用SortaseA作为一种蛋白质或多肽的连接工具以来，SortaseA参与的连接反应迅速成为一个研究热点，已被广泛应用于生物化学、蛋白质组学、生物医药以及生物工程技术等领域。但是目前SortaseA的应用依然存在以下的几个问题：(1)在大肠杆菌中SortaseA的表达水平很低；(2)表达所得SortaseA需要经过菌体破壁、分离纯化等多个步骤，繁琐的工艺和较高的成本也限制了SortaseA的应用；(3)介导蛋白修饰的SortaseA被直接添加至反应体系中，反应结束后SortaseA不易分离无法重复使用，且会给产物纯化带来困难；(4)固定于树脂上的SortaseA虽利于产物纯化，但其催化蛋白修饰的反应产率较低。因此，如何能更有效、更简便的实现SortaseA在蛋白修饰中的应用已成为目前急需解决的关键问题。
技术实现思路
为了解决SortaseA在蛋白修饰应用中存在的问题，本专利技术利用可以特异性吸附转肽酶SortaseA的磁珠，将SortaseA一步固定至磁珠上，用于催化蛋白或短肽连接、修饰反应。所述转肽酶SortaseA可以是微生物发酵得到的粗酶液或者纯酶。在本专利技术的一种实施方式中，以磁珠固定SortaseA时，调整两者用量比例使磁珠达到吸附饱和。在本专利技术的一种实施方式中，将C端带有His6标签的SortaseA的酶液与HisTag标签蛋白亲和镍磁珠进行结合，制备可用于催化反应的SortaseA结合磁珠。在本专利技术的一种实施方式中，将3mL以上活力为90.2mg/L的酶液与磁珠以体积比为6:1-30:1的比例混合，于4-25℃结合30min以上进行固定化，酶液的pH调整为pH值5.0-8.0。在本专利技术的一种实施方式中，所述磁珠可采用HisTag标签蛋白螯合磁珠(海狸纳米科技有限公司，产品货号：70501-100)。所述蛋白或短肽连接、修饰反应包括：蛋白与蛋白大分子之间的连接反应、蛋白与小分子底物(例如，荧光素标签分子、Biotin等生物亲和标签、特异性化学标记基团等)之间的连接反应、蛋白与树脂之间的连接反应、蛋白自身环化反应、短肽与蛋白大分子之间的连接反应、短肽与短肽之间的连接反应、短肽与树脂之间的连接反应、短肽自身环化反应。在本专利技术的一种实施方式中，所述酶液的获得，是以pET22a为表达载体，并利用载体上自带的PelB信号肽构建携带编码SortaseA的基因(SEQIDNO.1)的重组表达载体，将重组表达载体与分子伴侣pG-Tf2质粒共同转化至大肠杆菌E.coliBL21(DE3)得到重组菌，在TB培养基中，30℃诱导培养重组菌36h后获得90.2mg/L的胞外C端带有His6标签的SortaseA酶液。本专利技术所得磁珠的酶活可达318.2U/200μL磁珠；磁珠与SortaseA结合后颗粒平均直径由19μm增加到34μm；粗酶液中的SortaseA可以完全被磁珠结合，且磁珠仅仅特异性结合C端带有His6标签的SortaseA。利用上述制备的SortaseA结合磁珠直接催化短肽与短肽之间的转肽连接反应(37℃，12h)，并将反应后的磁珠洗涤回收后循环使用(5次)，检测每次催化反应所得产率。结果表明，SortaseA结合磁珠催化的转肽连接反应其特征在于：最高产率(81.8％)与游离酶催化产率相比(76.8％)提高了5.5％，维持大于75％的产率磁珠可至少循环使用5次以上。附图说明图1SortaseA结合前后磁珠的直径变化检测，(A)初始磁珠：磁珠平均直径(19μm)，(B)SortaseA结合后磁珠：磁珠平均直径(34μm)。图2磁珠与粗酶液中的SortaseA结合情况的SDS-Page检测；1、发酵上清，2、磁珠吸附后发酵上清，3、10mM咪唑磁珠洗脱结果；4、500mM咪唑磁珠洗脱结果。图3SortaseA结合磁珠催化的短肽与短肽之间的转肽连接反应产物的HPLC检测。图4SortaseA结合磁珠重复循环利用(5次)催化的短肽与短肽之间的转肽连接反应的产率。具体实施方式SortaseA胞外表达方法：以2％的接种量将构建好的SortaseA分泌表达型重组大肠杆菌(LB培养基)接种至装液量为50mL的500mL三角瓶中；发酵培养基为TB培养基(蛋白胨12.0g/L，酵母粉24.0g/L，甘油4.0g/L，KH2PO42.31g/L、K2HPO412.54g/L，pH7.0)；采用的发酵条件为：发酵温度30℃、诱导培养36h、诱导剂IPTG浓度100mM/L、诱导时机OD600＝0.6。蛋白含量的测定：使用碧云天生物技术研究所研发的Bradford蛋白浓度测定试剂盒进行检测，具体操作步骤参看试剂盒使用说明。磁珠固定化SortaseA酶活测定方法：利用SortaseA能够切断肽段LPXTG序列中Thr和Gly之间肽键的原理，合成了特异性底物Dabcyl-QALPETGEE-Edans(d-QALPETGEE-e)(吉尔生化有限公司)，其中Edans(e)是荧光基团，而Dabcyl(d)是淬灭基团。当该底物未被SortaseA切断时，Edans(e)在激发状态下发生荧光共振能量转移，其发出的荧光被临近的Dabcyl(d)吸收并以热的形式散发，荧光被淬灭，无法检测到荧光。而当SortaseA将底物切割成两段之后，Edans(e)与Dabcyl(d)分离，不再发生淬灭，即可检测到其荧光值。因此可通过Edans(e)荧光强度的变化来检测SortaseA的酶活性。检测方法是在96孔板中加入200μL反应缓冲液，4μLd-QALPETGEE-e底物(1.25g/L)，一定量的固定化SortaseA磁珠。混合液于SynergyTMH4全功能酶标仪(BioTek)中37℃下进行动力学反应1h，在激发波长350nm、发射波长495nm下检测荧光强度的变化情况。单位体积菌体SortaseA酶活计算公式如下：其中A代表单位质量菌体SortaseA酶活(U/mL)，I60为反应60min结束时的荧光强度值，I0为动力学反应开始时的荧光强度值，VL为固定化SortaseA磁珠使用量(μL)。实施例1SortaseA胞外表达粗酶液的制备以pET22a为表达载体，并利用载体上自带的PelB信号肽构建携带编码SortaseA的基因(SEQIDNO.1)的重组表达载体，将重组表达载体与分子伴侣pG-Tf2质粒共同转化至大肠杆菌E.coliBL21(DE3)。以TB培养基(蛋白胨12g/L，酵母粉24g/L，甘油4g/L，KH2PO423.1g/L，K2HPO4125.4g/L)为发酵培养基，500mL摇瓶装液50mL，发酵温度30℃，接种量2％，诱导时机OD600＝0.6、诱导温度30℃、诱导剂IPTG浓度100mM/L，诱导发酵时间36h。所得发酵液经过离心(12000rpm离心5分钟)去除菌体后可得90.2mg/L的SortaseA胞外粗酶液。实施例2So本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种应用转肽酶SortaseA修饰蛋白或多肽的方法，其特征在于，利用特异性吸附转肽酶SortaseA的磁珠，将SortaseA固定至磁珠上，用于催化蛋白或短肽的连接、修饰反应。

【技术特征摘要】
1.一种应用转肽酶SortaseA修饰蛋白或多肽的方法，其特征在于，利用特异性吸附转肽酶SortaseA的磁珠，将SortaseA固定至磁珠上，用于催化蛋白或短肽的连接、修饰反应。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将C端带有His6标签的SortaseA的酶液与HisTag标签蛋白亲和镍磁珠进行结合。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，以磁珠固定SortaseA时，调整两者用量比例使磁珠达到吸附饱和。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述转肽酶SortaseA是微生物发酵得到的酶液或者纯酶，或者商业化成品酶。5.根据权利要求1或4所述的方法，其特征在于，酶液的pH调整为pH值5.0-8.0，将3mL以上活力为90.2mg/L的酶液与磁珠以体积比为6:1-30:1的比例混合，于4-25℃结合30min以上进行固定化。6.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述磁珠可采用HisTag标签蛋白螯合磁珠。7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴志猛，赵鑫锐，洪皓飞，邓涛，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32