稳定化还原剂及其使用方法技术

本公开提供了稳定化还原剂及将其用于样品制备的方法。本文描述的稳定化还原剂为发生副反应的还原剂提供了易于使用的替代还原剂，所述副反应可致使其作为还原剂无效和/或降低可用还原剂的浓度。在一些情况下，稳定化还原剂是可以在向所述还原剂施加刺激之后活化的可活化还原剂。

Stabilizing reducing agent and its use method

The present disclosure provides a stabilizing reducing agent and a method for the preparation of the sample. The stabilisation reductant described in this paper provides an easy to use substitute for reducing agents for the occurrence of side reactions. The side reaction can cause it to be invalid as reductant and / or reduce the concentration of available reductant. In some cases, the stabilizing reductant is an activable reductant that can be activated after stimulation of the reductant.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】稳定化还原剂及其使用方法交叉引用本申请案要求2015年5月18日提交的美国临时专利申请案序列号62/163,298的优先权，该申请案以引用的方式整体并入本文用于所有目的。专利技术背景许多关键反应对反应混合物中存在的各种试剂的浓度都高度敏感，使得只有当某些试剂在非常狭窄的浓度窗口范围内存在时才可以实现有效反应。在一些情况下，这可能是由于反应中所涉及的计量化学，其中特定试剂的浓度超过反应所需的浓度可能有毒。在其它情况下，指定试剂的瞬变特性，例如不稳定性、挥发性或交叉反应性，可能需要其在特定时刻以指定浓度存在于反应中。在使用这些瞬变试剂执行化学过程中可产生困难，因为它们可能需要在每次使用之前制备新鲜试剂，需要在高度受控且可能是次优的条件下使用，和/或在通过反应试剂盒将反应过程转移给其他人(例如消费者)中产生极度困难等。专利技术概要期望能够通过提供稳定化试剂组合物为瞬变试剂提供替代试剂，稳定化试剂组合物可以更精确地提供所需浓度的指定反应物，同时呈易于为广泛不同技巧水平的研究人员使用的稳固宽容形式提供反应物。本公开解决了这些和其它需求。本公开提供了稳定化还原剂及其使用方法。稳定化还原剂可用于各种情况，包括样品制备。而且，还原剂的稳定可使其成为可活化还原剂。此类稳定化、可活化还原剂可在向还原剂施加刺激后活化。本公开的一个方面提供了一种用于核酸扩增的方法。该方法包括在反应体积中提供试剂，其中所述试剂包含第一组分，所述第一组分通过可还原键联与第二组分偶联，并且其中所述反应体积包括模板核酸分子和稳定化还原剂；借助于稳定化还原剂裂解所述可还原键联以使第一组分与第二组分去偶联；并且使用第一组分，使模板核酸分子经受扩增反应，以得到作为所述模板核酸分子扩增产物的核酸分子。在一些情况下，在使模板核酸分子经受扩增反应之前，所述稳定化还原剂对于可还原键联的还原活性可有至多20％的变化。在一些情况下，在使模板核酸分子经受扩增反应之前，所述稳定化还原剂对于可还原键联的还原活性可有至多10％的变化。在一些情况下，在使模板核酸分子经受扩增反应之前，所述稳定化还原剂对于可还原键联的还原活性可有至多5％的变化。在一些情况下，在使模板核酸分子经受扩增反应之前，所述稳定化还原剂对于可还原键联的还原活性可有至多1％的变化。而且，在一些情况下，使模板核酸分子经受扩增反应可包括使所述反应体积的温度循环。在一些情况下，使模板核酸分子经受扩增之后，所述方法还包括提供所述扩增产物的至少一部分的序列。在一些情况下，所述稳定化还原剂包含含稳定化硫醇的化合物。在一些情况下，所述含稳定化硫醇的化合物包含空间受阻的硫醇基团。在一些情况下，所述含稳定化硫醇的化合物包含青霉胺。在一些情况下，第二组分包含珠粒。在一些情况下，第一组分包含核酸分子且第二组分包含大分子基质。在一些情况下，所述大分子基质包含聚合物基质。在一些情况下，所述聚合物基质包含水凝胶。在一些情况下，所述水凝胶包含交联聚丙烯酰胺。在一些情况下，所述交联聚丙烯酰胺通过可还原交键联交联，并且所述方法还可包括在使模板核酸分子经受扩增反应之前裂解所述可还原交键联。在一些情况下，所述可还原交键联包括二硫键联。在一些情况下，所述可还原键联包括连接所述核酸分子与所述聚合物基质的二硫键联。在一些情况下，所述核酸分子包含条码序列。在一些情况下，所述扩增产物包含条码序列。在一些情况下，所述扩增产物包含局部发夹结构。在一些情况下，在油包水乳液中的液滴的水性内部提供所述反应体积。在一些情况下，所述反应体积包含酶，例如，参与所述扩增反应的聚合酶。在一些情况下，在一些情况下，在一些情况下，在一些情况下，所述第一组分包含参与所述扩增反应的引物。另一方面，本公开提供了一种进行还原反应的方法。该方法包括在反应体积中提供试剂，其中所述试剂包含第一组分，所述第一组分通过可还原键联与第二组分偶联，并且其中所述反应体积包括呈非活性状态的还原剂，使得所述还原剂与所述可还原键联基本上不反应；使所述还原剂经受活化条件，使得所述还原剂变得与所述可还原键联有反应性；并且容许所述还原剂与所述可还原键联反应以使所述第一组分与所述第二组分去偶联。在一些情况下，该方法还包括测定所述扩增产物的至少一部分序列的序列。在一些情况下，所述反应体积包括模板核酸分子并且所述第一组分包含引物。所述方法还可包括在容许所述还原剂与可还原键联反应之后，使用所述第一组分，使所述模板核酸分子经受扩增反应，以得到作为所述模板核酸分子扩增产物的核酸分子。在一些情况下，所述引物包含条码序列。在一些情况下，所述活化条件包括向所述反应体积添加热能。在一些情况下，所述活化条件裂解所述还原剂的共价键。在一些情况下，呈其非活性状态的所述还原剂是稳定化还原剂。在一些情况下，所述稳定化还原剂包含含稳定化硫醇的化合物。在一些情况下，所述含稳定化硫醇的化合物包含空间受阻的硫醇基团。在一些情况下，所述含稳定化硫醇的化合物包含经取代的二硫丁胺(DTBA)。在一些情况下，所述经取代的DTBA包含：在一些情况下，所述第二组分包含珠粒。在一些情况下，所述第一组分包含核酸分子且所述第二组分包含大分子基质。在一些情况下，所述大分子基质包含聚合物基质。在一些情况下，所述聚合物基质包含水凝胶。在一些情况下，所述水凝胶包含交联聚丙烯酰胺。在一些情况下，所述交联聚丙烯酰胺通过可还原交键联交联。在一些情况下，所述可还原交键联包括二硫键联。在一些情况下，在使所述还原剂经受活化条件之后，所述方法还包括裂解所述可还原交键联。在一些情况下，所述可还原键联包括连接所述核酸分子与所述聚合物基质的二硫键联。在一些情况下，所述核酸分子包含条码序列。在一些情况下，在油包水乳液中的液滴的水性内部提供所述反应体积。在一些情况下，所述反应体积包含酶，其可以是，例如聚合酶。另一方面，本公开提供了一种还原剂，其包含：本公开另外的方面和优点对于本领域的技术人员而言从下列详细描述将变得显而易见，其中仅示出并描述了本公开的说明性实施方案。正如将意识到的那样，本公开能够有其它不同的实施方案，并且其几个细节能够在各个明显方面进行修改，其全部都不背离本公开。因此，本质上要将附图和说明书视为说明性的，而非限制性的。以引用方式并入本说明书中提到的所有公开案、专利和专利申请以引用的方式并入本文，其程度如同特别地且单独地指出将每个单独的公开案、专利或专利申请以引用的方式并入一样。在以引用的方式并入的公开案和专利或专利申请与本说明书中所含的公开内容矛盾的程度上，本说明书旨在取代和/或优先于任何此类矛盾材料。附图简述在所附权利要求书中特别阐述了本专利技术的新颖特征。参考以下阐述说明性实施方案(其中利用了本专利技术的原理)的详细描述和附图(本文也称为“图片”和“图”)，将获得对本专利技术特征和优点更好的理解，图中：图1提供了示例还原剂的化学结构；图2提供了二硫苏糖醇(DTT)氧化的图示(图A)、二硫丁胺(DTBA)氧化的图示(图B)和本文描述的示例经取代的DTBA还原剂的功能性的图示(图C)；图3(图A-F)提供了用于核酸片段条码化和扩增的示例方法的示意图；图4提供了在实施例1中描述的实验中获得数据的图示；图5(图A和B)提供了在实施例2中描述的实验中获得数据的图示；图6(图A、B和C)提供了在实本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于核酸扩增的方法，其包括：(a)在反应体积中提供试剂，其中所述试剂包含第一组分，所述第一组分通过可还原键联与第二组分偶联，并且其中所述反应体积包括模板核酸分子和稳定化还原剂；(b)借助于所述稳定化还原剂裂解所述可还原键联以使所述第一组分与所述第二组分去偶联；并且(c)使用所述第一组分，使所述模板核酸分子经受扩增反应，以得到作为所述模板核酸分子扩增产物的核酸分子，其中在(c)之前，所述稳定化还原剂对于所述可还原键联的还原活性有至多20％的变化。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.05.18 US 62/163,2981.一种用于核酸扩增的方法，其包括：(a)在反应体积中提供试剂，其中所述试剂包含第一组分，所述第一组分通过可还原键联与第二组分偶联，并且其中所述反应体积包括模板核酸分子和稳定化还原剂；(b)借助于所述稳定化还原剂裂解所述可还原键联以使所述第一组分与所述第二组分去偶联；并且(c)使用所述第一组分，使所述模板核酸分子经受扩增反应，以得到作为所述模板核酸分子扩增产物的核酸分子，其中在(c)之前，所述稳定化还原剂对于所述可还原键联的还原活性有至多20％的变化。2.根据权利要求1所述的方法，其中在(c)之前，所述稳定化还原剂对于所述可还原键联的还原活性有至多10％的变化。3.根据权利要求1所述的方法，其中在(c)之前，所述稳定化还原剂对于所述可还原键联的还原活性有至多5％的变化。4.根据权利要求1所述的方法，其中在(c)之前，所述稳定化还原剂对于所述可还原键联的还原活性有至多1％的变化。5.根据权利要求1所述的方法，其中所述经受包括使所述反应体积的温度循环。6.根据权利要求1所述的方法，其中所述稳定化还原剂包含含稳定化硫醇的化合物。7.根据权利要求6所述的方法，其中所述含稳定化硫醇的化合物包含空间受阻的硫醇基团。8.根据权利要求6所述的方法，其中所述含稳定化硫醇的化合物包含青霉胺。9.根据权利要求1所述的方法，其中所述第二组分包含珠粒。10.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一组分包含核酸分子且所述第二组分包含大分子基质。11.根据权利要求10所述的方法，其中所述大分子基质包含聚合物基质。12.根据权利要求11所述的方法，其中所述聚合物基质包含水凝胶。13.根据权利要求12所述的方法，其中所述水凝胶包含交联聚丙烯酰胺。14.根据权利要求13所述的方法，其中所述交联聚丙烯酰胺通过可还原交键联交联。15.根据权利要求14所述的方法，其中所述可还原交键联包括二硫键联。16.根据权利要求14所述的方法，其还包括在(c)之前，裂解所述可还原交键联。17.根据权利要求11所述的方法，其中所述可还原键联包括连接所述核酸分子与所述聚合物基质的二硫键联。18.根据权利要求12所述的方法，其中所述核酸分子包含条码序列。19.根据权利要求18所述的方法，其中，在(c)中，所述扩增产物包含所述条码序列。20.根据权利要求1所述的方法，其中所述扩增产物包含局部发夹结构。21.根据权利要求1所述的方法，其还包括，在(c)之后，提供所述扩增产物的至少一部分的序列。22.根据权利要求1所述的方法，其中在油包水乳液中的液滴的水性内部提供所述反应体积。23.根据权利要求1所述的方法，其中在(a)中，所述反应体积包含酶。24.根据权利要求23所述的方法，其中所述酶是参与所述扩增反应的聚合酶。...

【专利技术属性】
技术研发人员：劳伦斯·格林菲尔德，克里斯多佛·辛德森，
申请(专利权)人：一零X基因组学有限公司，
类型：发明
国别省市：美国,US