高亲和结合免疫球蛋白G的短肽及应用制造技术

一种高亲和结合免疫球蛋白G的短肽及应用，所述短肽(a)由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列组成的短肽，并且通过两端的半胱氨酸巯基形成二硫键构成环状结构；(b)在(a)限定的氨基酸序列中经过缺失、插入或置换一个或几个氨基酸且与(a)具有相同生物学功能的由(a)衍生的短肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，并且通过两端的半胱氨酸巯基形成二硫键构成环状结构。本发明专利技术还包括高亲和结合免疫球蛋白G的短肽及应用。本发明专利技术筛选的短肽与免疫球蛋白G高度亲和，经过体外亲和能力动力学测定，该短肽结合IgG的结合常数KD可达到7.02E‑06M。

The short peptide of high affinity binding immunoglobulin G and its application

Short peptide and application of a high affinity binding of immunoglobulin G, the peptide (a) peptide consisting of amino acid sequences shown by SEQ ID NO:1, and two disulfide bonds forming a ring structure formed by the ends of the cysteine sulfhydryl group; (b) (a) in amino acid sequence defined in after deletion, insertion or substitution of one or several amino acid and (a) have the same biological function by (a) peptide derivative, the amino acid sequence of SEQ ID NO:2 shows, and two disulfide bonds forming a ring structure formed by the ends of the cysteine sulfhydryl group. The invention also includes short peptides and applications of high affinity binding immunoglobulin G. The screening of short peptides with high affinity immunoglobulin G, after in vitro affinity assay, the IgG binding peptides binding constant KD can reach 7.02E 06M.

【技术实现步骤摘要】
高亲和结合免疫球蛋白G的短肽及应用
本专利技术涉及一种短肽及应用，具体涉及一种高亲和结合IgG的短肽及应用。
技术介绍
免疫球蛋白G(IgG)，即抗体，是在脾脏和淋巴结中合成，在人体血清中的含量最高，占血清总Ig的75％～80％，而且在血清中半衰期长，主要分布在血清和组织液中，是抗细菌、抗毒素和抗病毒抗体的主要组成部分，也是机体抗感染免疫的过程中的重要物质基础。IgG分子的基本结构是由四肽链组成的，即2条较长、相对分子量较大的相同的重链(H链)；2条较短、相对分子量较小的相同的轻链(L链)，各个链之间以二硫键相连，从而使整个分子具有一定的灵活性。IgG分子可分为恒定区和可变区两部分，分子中没有轻链的部分称为可变区或Fc段(可结晶部分)，此区域是由一组固定的基因所决定，同一个种属中的所有同亚型抗体此区域是一致的；分子中既有重链又有轻链的部分称为恒定区或Fab段(抗原结合区)，此区域的极端包含识别并结合靶抗原表位的高可变位点，Fab段也是由一组固定的基因决定，但需要进一步的体细胞突变产生独特的和高特异的可变位点。抗体可以结合一个特定结构域(表位区域)的蛋白质与多结构域，从而阻止一部分复合物只有一种蛋白质的功能。可见，抗体因其具有高度的结合特异性靶抗原，是免疫检测的关键因素，已成为检测或调控蛋白质功能的关键工具，可用于疾病诊断或实验室检测生物分子。此外，由于抗体对细胞膜的不渗透性，使用治疗性抗体可通过阻断蛋白质的功能来治愈疾病疾病，而抗体偶联药物(ADC)会显著增强这种渗透治疗效果。但是，在大多数情况下，ADC药物是通过适当的化学接头对共价连接抗体，由于化学连接一般不能很好的定点连接，可能会损害抗体内在功能或结构完整性的交联化学反应，至今仍然存储着没法克服的缺陷。近年来，为了将抗体输送到活细胞中，已开发许多相关技术，其中具有代表性的方法包括将抗体蛋白结合在脂质体的表面，可具有靶向性，然而由于脂质体存在靶向性不够明显，包封率和稳定性差，载药量相对较低，制备工艺复杂等缺点，特别是脂质体毒性较大，在活体研究中发现其会在肺部聚集并造成炎症，并且与DNA包裹形成的颗粒粒径较大(>500nm)，不利于进入肿瘤组织发挥作用。因此，限制了脂质体的广泛应用。现已研究证明IgG结合肽(FcBP)由于具有可逆和位点特异性的结合抗体部位，可用于抗体-药物偶联。通过将药物连接在短肽上，然后利用短肽定点到抗体上，就可以实现抗体药物的稳定合成，从而为药物在活体内的靶向性提供了非常方便的功能链接工具，而且短肽在生物组织中的穿透性更佳，毒性较低，合成上也更为容易并具有较低的免疫原性。但是，直链短肽虽然在体外具有很好的生物活性和稳定性，但是进入体内后因体内环境复杂，存在各种各样的酶，导致直链短肽在酶的作用下很快降解，活性丧失；另外，直链肽在液相里的构象柔性使得不大容易符合受体的构象要求，这些不利因素造成直链短肽仍有许多问题有待解决。因此，由于线性小肽的亲和力和特异性仍不能满足临床应用的需求，迫切需要获得更高亲和力和特异性的多肽分子。噬菌体展示技术是一种快速高通量的蛋白多肽展示技术，其原理是将多肽或蛋白质的编码基因或目的基因片段克隆入噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，在阅读框正确且不影响其他外壳蛋白正常功能的情况下，使外源多肽或蛋白与外壳蛋白融合表达，融合蛋白随子代噬菌体的重新组装而展示在噬菌体表面。被展示的多肽或蛋白可以保持相对独立的空间结构和生物活性，以利于靶分子的识别和结合，在该技术基础上通过反复的结合-洗脱-单克隆扩增可定向、快速、高通量的筛选高亲和的靶向抗体及功能型多肽。目前，利用随机合成的方法，可以将多达109的不同多肽序列展示到噬菌体表面，建立起一个大库容的多肽库，筛选出不同需求的多肽，并以此结合肽为载体与药物相连，这样可以有效地提高定向传递治疗药物的能力。但是应用噬菌体展示随机肽库技术筛选既能与IgG高亲和结合，又能作为靶向抗体药物连接子的短肽的研究，到目前为止鲜有报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是通过以下技术方案实现的，一种高亲和结合免疫球蛋白G的短肽：(a)由SEQIDNO:1所示的氨基酸序列组成的短肽，并且通过两端的半胱氨酸巯基形成二硫键构成环状结构；(b)在(a)限定的氨基酸序列中经过缺失、插入或置换一个或几个氨基酸且与(a)具有相同生物学功能的由(a)衍生的短肽，其氨基酸序列如SEQIDNO:2所示，并且通过两端的半胱氨酸巯基形成二硫键构成环状结构。进一步，(b)中，插入的连接子为GGGS。进一步，所述免疫球蛋白G为人源化免疫球蛋白G。本专利技术进一步的目的是通过以下技术方案实现的，一种分离的多核苷酸，包含编码所述的短肽的核酸序列。本专利技术进一步的目的是通过以下技术方案实现的，一种核酸构建体，包含所述的多核苷酸。本专利技术进一步的目的是通过以下技术方案实现的，一种重组表达载体，包含所述的核酸构建体。本专利技术进一步的目的是通过以下技术方案实现的，一种重组宿主，包含所述的核酸构建体或所述的重组表达载体。进一步，所述宿主为大肠杆菌。本专利技术进一步的目的是通过以下技术方案实现的，一种生产高亲和结合免疫球蛋白G的短肽的方法，通过在重组宿主中表达编码所述短肽的核酸序列，形成包含所述短肽的包涵体，然后回收短肽。本专利技术进一步的目的是通过以下技术方案实现的，一种高亲和结合免疫球蛋白G的短肽在制备抗体偶联药物中的应用。本专利技术先将靶标IgG蛋白标上生物素(生物素化试剂可选磺基琥珀酰亚胺-6-(生物素)己酸，例如EZ-LinkSulfo-NHS-LC-Biotin生物素化试剂盒，或磺基琥珀酰亚胺-6-(生物素酰化)己酸，例如EZ-LinkSulfo-NHS-LCBiotinylationKits生物素化试剂盒。可见，生物素化试剂中包含一个存在于NHS环上的带负电荷的磺酸基，使其分子内产生足够的极性，水溶性好，允许其可以直接加入到反应性水溶液中，而不需要提前溶解在有机溶剂中，在生理条件下就可进行生物素标记。)，然后将其固定到链亲合素磁珠上(链霉亲和素磁珠是由超顺磁性微珠与高纯度链霉亲和素共价结合而成，粒径均一、形貌规整，有利于方便、快捷地捕获目标分子，可轻松和生物素化的IgG蛋白结合。)，最后利用噬菌体展示技术经过多轮生物淘选，获得了一条高亲和结合人源IgG蛋白的环肽序列，命名为IgG12C:(0)CSKEATPFC，环肽因其具有明确的固定构象，能够与受体很好地契合，加上分子内不存在游离的氨基端和羧基端使得对氨肽酶和羧肽酶的敏感性大大降低，因此其生物活性半衰期长，受体选择性高，使得环肽的代谢稳定性和生物利用度远远高于直链肽。由此可见，本专利技术为了筛选高亲和结合的短肽，利用生物素链亲合素结合特异性好，结合能力强，接近于共价结合，可以耐受加热、酸、碱、高浓度的尿素和盐溶液，且对IgG蛋白浓度和纯度要求均不高，IgG蛋白活性也不受影响，从而在后续筛选高亲和结合短肽中，在高强度的洗涤过程中，靶标蛋白不易与磁珠脱离。本专利技术高亲和结合人源IgG蛋白的环肽序列直接利用多肽合成仪进行合成，经过体外亲和能力动力学测定，IgG12C结合IgG的结合常数KD达到7.02E-06M，(IG12C)2结合IgG的结合常数KD达到9.37E-08M。本专利技术的优点在于本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种高亲和结合免疫球蛋白G的短肽，其特征在于，(a)由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列组成的短肽，并且通过两端的半胱氨酸巯基形成二硫键构成环状结构；(b)在(a)限定的氨基酸序列中经过缺失、插入或置换一个或几个氨基酸且与(a)具有相同生物学功能的由(a)衍生的短肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，并且通过两端的半胱氨酸巯基形成二硫键构成环状结构。

【技术特征摘要】
1.一种高亲和结合免疫球蛋白G的短肽，其特征在于，(a)由SEQIDNO:1所示的氨基酸序列组成的短肽，并且通过两端的半胱氨酸巯基形成二硫键构成环状结构；(b)在(a)限定的氨基酸序列中经过缺失、插入或置换一个或几个氨基酸且与(a)具有相同生物学功能的由(a)衍生的短肽，其氨基酸序列如SEQIDNO:2所示，并且通过两端的半胱氨酸巯基形成二硫键构成环状结构。2.根据权利要求1所述的高亲和结合免疫球蛋白G的短肽，其特征在于，(b)中，插入的连接子为GGGS。3.根据权利要求1或2所述的高亲和结合免疫球蛋白G的短肽，其特征在于，所述免疫球蛋白G为人源化免疫球蛋白G。4.一种分离的多核苷酸，其特征在于，包含...

【专利技术属性】
技术研发人员：林坚，李承鹏，陈鹏，
申请(专利权)人：北京大学，
类型：发明
国别省市：北京,11