抗衰老短肽及其制备方法技术

本发明专利技术涉及基因工程领域重组蛋白的制备方法，具体是一种新型抗衰老短肽及制备方法。本发明专利技术公开了一种抗衰老短肽命名为G13，由13个氨基酸所组成；同时公开了一种利用大肠杆菌发酵的工艺，可以实现工业化大规模的制备重组G13（简称rG13）。本发明专利技术利用多种生物学手段检测，证实rG13具有比同类产品更高的生物学活性，能够刺激细胞大量分泌胶原蛋白，具有抗衰老的能力。本发明专利技术所述的抗衰老短肽生物活性显著，生产工艺简单，成本低廉，能够让抗衰老皮肤营养产品走近百姓的日常生活，具有广阔的市场应用前景。

【技术实现步骤摘要】
抗衰老短肽及其制备方法
本专利技术涉及基因工程领域重组蛋白的设计和制备方法，具体是一种新型抗衰老短肽及其制备方法。
技术介绍
人和高等动物的皮肤由表皮、真皮、皮下组织组成。表皮没有血管，细胞的能量和营养必须由真皮微循环提供。真皮层是皮肤的生命源泉，是一层致密、坚韧且有弹性的组织，主要由纤维成分（胶原蛋白纤维、弹力纤维和网状纤维）、糖蛋白、氨基葡萄糖和玻尿酸等组成。玻尿酸是一种透明的胶状物质，吸水能力可达500-1000倍，是公认的最佳保湿产品。年轻的皮肤，玻尿酸含量高，皮肤光滑、弹性、水嫩、膨胀饱满；皮肤老化时，真皮层变薄，减少了真皮层与表皮层之间物质交换的界面，细胞的正常代谢和有丝分裂作用受到阻碍，皮肤萎缩产生皱纹，因此抗衰老要从补充真皮层营养物质（如胶原蛋白和玻尿酸等）开始。胶原蛋白可以弥补基底膜功能，帮助表皮层与真皮层的结合，能够将水分、养分保送至真皮层。因此，如果能够补充人体皮肤中的胶原蛋白，将能够有效地对抗皮肤衰老的问题。棕榈酸五胜肽-3（Pentapeptide-3）别名五环短肽或五胜月肽，它是由法国著名化妆品公司Sederma公司研发出品的一种人工合成的短肽。它能够有效促进透明质酸、胶原蛋白和弹力纤维增生，减少肌肤细纹，提高肌肤的含水量，增加皮肤厚度，增强肌肤紧致感和光泽度。它是胶原蛋白I（CollagenI）碎片与棕榈酸（PalmiticAcid）结合后得到的对皮肤更具亲和性和亲水、锁水性的物质。研究表明，若将棕榈酸五胜肽-3加入纤维组织母细胞培养皿中，能加强胶原蛋白I、VII（纤维胶原)和纤维黏连蛋白的合成能力，还能促进表皮内的纤维母细胞产生胶原蛋白和玻尿酸等重要成分。可见，棕榈酸五胜肽-3对减轻皮肤老化有重要作用。试管内测试表明，棕榈酸五胜肽-3能迅速激活胶原蛋白IV合成能力达到100%～327%，激活玻尿酸的合成能力达到267%。如今，该短肽已经广泛应用于许多知名品牌的化妆品行列。目前，已经有很多国家的知名化妆品品牌的许多系列添加了棕榈酸五肽-3作为抗衰老的营养成分。我国上海和深圳的一些生物科技公司也有该产品销售。但是，目前棕榈酸五胜肽-3的制备方法还都是局限于化学合成，其高额的成本限制了这类产品的广泛使用。因此，为了能使这类短肽类的皮肤营养产品不断走近百姓的日常生活，使得普通人拥有安全、稳定、实用的高品质化妆品，有必要设计研发更加高效的抗衰老短肽，并探索大规模制备抗衰老短肽的技术。
技术实现思路
本专利技术为了提高现有抗衰老短肽—棕榈酸五肽-3的生物学活性，同时降低这类美容肽的生产成本，提供了一种新型抗衰老短肽的设计方案，并提供其大规模的制备方法。本专利技术是采用如下技术方案实现的：一种抗衰老短肽，由13个氨基酸所组成，其氨基酸序列为：Gly-Pro-Lys-Thr-Thr-Lys-Ser-Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln，用单字符号表示为GPKTTKSLEVLFQ。上述G13短肽可以通过多种生产工艺进行制备：1、利用大肠杆菌发酵的工艺，重组表达制备的G13，简称rG13，生产工艺简单，成本低廉，易于推广。2、利用化学合成的工艺合成G13，简称sG13，成本较高，但是具有与rG13类似的生物学功能。本专利技术提供上述的抗衰老短肽的制备方法，包括如下步骤：（1）、大肠杆菌基因工程菌的构建1.1、设计Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln-Gly-Pro-Lys-Thr-Thr-Lys-Ser（用单字符号表示为LEVLFQGPKTTKS）氨基酸序列为基本重复单元L13构建蛋白序列pL13-n，其中n为1-100的任意数值；1.2、合成如上所示蛋白序列相对应的核苷酸序列nL13：（ctggaagtgctgtttcagggcccgaagaccaccaagagc）n；1.3、将核苷酸序列nL13克隆进入表达载体，然后将表达载体转入大肠杆菌表达菌株中，筛选得到大肠杆菌基因工程菌；（2）大肠杆菌基因工程菌的发酵培养2.1、挑取优选后的大肠杆菌基因工程菌单菌落，置于LB培养基中35～38℃培养过夜；2.2、将菌液接种放大培养，35～38℃培养2.5～3小时，加入IPTG进行诱导，15～18℃继续培养18～22小时，此时表达出的蛋白为GST-pL13-n，离心收集菌体；（3）重组抗衰老短肽rG13的纯化3.1、用Tris缓冲液重悬细菌，超声破碎，离心收集上清液；3.2、利用谷胱甘肽亲和柱从上清液中纯化得到抗衰老短肽rG13。本专利技术所述的rG13短肽检测活性如下：1、抗衰老短肽rG13理论分子量为1447.65Da，无法通过常规的SDS-PAGE进行检测，需要利用质谱方法进行鉴定。用基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱仪MALDI-TOFAXIMA-CFRPlus（KRATOSAnalytical，Shimadzucorporation，Japan)在线性模式下进行分析。分析结果如图2所示。2、细胞分泌胶原蛋白的过程中，TGF-β会大量表达。因此，TGF-β表达量的增高指示着细胞合成胶原蛋白的增强。以大鼠腱细胞为模型，加入不同浓度的短肽（0.2μg/ml,2μg/ml，20μg/ml，200μg/ml），24小时之后收集大鼠腱细胞上清，直接转移到TGF-β的检测试剂盒中进行检测。分析结果如图3所示。3、利用标准的MTT法检测抗衰老短肽rG13的细胞毒性。参考标准mtt法的操作方法，加入不同浓度的短肽（0.2μg/ml，2μg/ml，20μg/ml，200μg/ml），24小时之后检测细胞活性。分析结果如图4所示。4、免疫组化方法检测抗衰老短肽rG13刺激细胞合成胶原蛋白的效果。以大鼠腱细胞为模型，加入短肽（浓度为20μg/ml）24小时之后，4%多聚甲醛固定，3%BSA封闭，然后用兔抗鼠胶原蛋白的抗体（Novotec，SaintMartinLaGarenne，France）进行标记1小时。用荧光显色，然后镜下观察即可。分析结果如图5所示。与现有技术相比，本专利技术制备的抗衰老短肽rG13具有以下特点：1、本专利技术所公开的新型抗衰老短肽G13（GPKTTKSLEVLFQ），为长期筛选优化的序列，比市场上同类产品效果显著提高。2、本专利技术所公开的新型抗衰老短肽rG13的制备方法，采用大肠杆菌表达系统，适于大规模放大，生产成本非常低，而且基因中的序列针对大肠杆菌表达系统进行了密码子优化，进一步提高了产量。3、本专利技术产品经过多项活性检测，具有目前报道过的最优化的抗衰老效果，可以广泛应用于生物医药和化妆品行业。本专利技术利用多种生物学手段检测，证实抗衰老短肽rG13具有比同类产品更高的生物学活性，能够刺激细胞大量分泌胶原蛋白，具有抗衰老的能力。本专利技术所述的抗衰老短肽生物活性显著，生产工艺简单，成本低廉，能够让抗衰老皮肤营养产品走近百姓的日常生活，具有广阔的市场应用前景。附图说明图1表示表达载体pGEX-6p-nL13-9的质粒构建图谱。图2表示提纯产物中抗衰老短肽rG13的质谱鉴定结果。rG13的理论分子量为1447.65Da，与质谱检测结果完全吻合。图3表示抗衰老短肽rG13刺激TGF-β表达的能力的检测结果。与空白对照组、棕榈酸五肽-3（K5）、合成的G13短肽（sG13）相比，重组表达制备的rG13本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抗衰老短肽，其氨基酸序列为：Gly‑Pro‑Lys‑Thr‑Thr‑Lys‑Ser‑Leu‑Glu‑Val‑Leu‑Phe‑Gln。

【技术特征摘要】
1.一种抗衰老短肽，其氨基酸序列为：Gly-Pro-Lys-Thr-Thr-Lys-Ser-Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln。2.一种制备权利要求1所述的抗衰老短肽的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：（1）、大肠杆菌基因工程菌的构建1.1、设计Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln-Gly-Pro-Lys-Thr-Thr-Lys-Ser氨基酸序列为基本重复单元L13，构建蛋白序列pL13-9，所述pL13-9为（Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln-Gly-Pro-Lys-Thr-Thr-Lys-Ser）9；1.2、合成如上所示蛋白序列相对应的核苷酸序列L13-9：（ctggaagtgctgtttcagggcccgaagaccaccaagagc）9；1.3、将核苷酸序列L13-9克隆进入表达载体，然后将表达载体转入大肠杆菌表达菌株中，筛选得到大肠杆菌基因工程菌；具体为，设计引物P1和P2，P1：CGACGGCCAGTGAATTCAGA，P2：CAGCTATGACCATGCTCGAGTCC，将引物和核苷酸序列进行PCR步骤，回收目的基因，用BamI和XhoI将核苷酸序列酶切成粘性末端，同样处理pGEX-6p-1载体，加入T4DNA连接酶，4℃连接12小时，转化大肠杆菌DH5α；用氨苄青霉素-LB平板筛选挑出白斑克隆，利用分子克隆的碱裂解法或者煮沸法提取质粒，利用酶切和PCR的方法鉴定正确，然后...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨霞，
申请(专利权)人：太原锦波生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：山西;14