一种利用枯草芽孢杆菌发酵生产维生素B2的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用枯草芽孢杆菌发酵生产维生素B2的方法，将枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 15‑1‑11斜面活化后，经过种子培养和发酵培养，发酵结束后，发酵液离心后取上清，即可制得维生素B2。本发明专利技术采用稳定、高产的维生素B2菌株：枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 15‑1‑11，同时结合特定的发酵工艺进行发酵生产维生素B2，发酵48小时后，发酵液中维生素B2的浓度提高6g/L以上，大大提高了维生素B2的产量，发酵成本大幅度降低，相对于现有技术而言，取得了显著性进步和出乎意料的效果。

【技术实现步骤摘要】
一种利用枯草芽孢杆菌发酵生产维生素B2的方法
本专利技术涉及一种生产维生素B2的方法，具体说，是涉及一种利用枯草芽孢杆菌发酵生产维生素B2的方法，属于生物工程

技术介绍
维生素B2(化学式：C17H20N4O6，式量376.37)又叫核黄素，是一种水溶性B族维生素。维生素B2是人和动物体必需的维生素之一，为黄素酶类辅酶的组成部分，在生物体内主要以黄素单核苷酸(FMN)和黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)的形式存在，参与机体组织呼吸链电子传递及氧化还原反应，在呼吸和生物氧化中起着重要作用，是生命活动中不可缺少的维生素。目前，工业上应用的维生素B2生产方法主要由化学合成法、化学半合成法和微生物发酵法三种。与化学合成法相比，微生物发酵法具有生产工艺简单、原料廉价以及对环境污染少、绿色可再生等优点。因此，生物方法生产维生素B2倍受世界维生素B2生产商的青睐，正在逐渐代替以石油为基础的化学合成法。维生素B2的生物发酵过程是一个复杂的代谢过程，发酵菌株和发酵工艺条件是影响微生物发酵产量和经济效益的关键因素。枯草芽胞杆菌(Bacillussubtilis)目前广泛的用于维生素B2的微生物发酵中，但是采用常规的枯草芽胞杆菌进行维生素B2的微生物发酵，其维生素B2的产量还是不够高，无法满足维生素B2工业的高产、节能要求。因此，需要对枯草芽胞杆菌进行优化培养，以制备出能高效合成维生素B2的枯草芽胞杆菌株。同时影响发酵过程的因素非常复杂，包括培养基组成、pH值、培养温度、通气量等一系列操作条件，这些条件往往不是独立影响发酵过程，而是常常存在交互作用的。因此，同时需要优化出一种适宜的发酵工艺。因此，需要开发出一种利用高产稳定的枯草芽胞杆菌生产维生素B2的方法。
技术实现思路
针对现有技术存在的上述问题，本专利技术的目的是提供一种利用枯草芽孢杆菌发酵生产维生素B2的方法，以克服现有技术中维生素B2产量不高的缺陷。为实现上述专利技术目的，本专利技术采用的技术方案如下：一种利用枯草芽孢杆菌发酵生产维生素B2的方法，包括如下步骤：a)菌株活化：将枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis15-1-11先转斜面在37℃培养箱中培养24-32h，准备移种；b)种子培养：将活化后的菌株以5％的接种量接入种子培养基中进摇瓶培养12-16h，培养温度40℃，转速240rpm，制得种子培养液；c)发酵培养：将种子培养液接入发酵罐中发酵培养基培养48-60h，发酵温度为38-40℃，以30％(v/v)NH4OH和1MH2SO4控制pH为6.7～6.9，控制通气比为0.8，使溶氧量达到20-30％，转速600rpm；d)维生素B2提取：发酵结束后，发酵液离心后取上清，即得维生素B2，检测发酵液中维生素B2的含量。作为优选方案，所述枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis15-1-11的制备，包括如下步骤：a1)原始菌株的预处理：将枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)原始菌株(例如枯草芽孢杆菌168)涂布于平板培养基上进行培养，培养得到的平板用蒸馏水进行洗吹，得到枯草芽孢杆菌原始菌株的菌液；b1)将步骤a1)得到的菌液在无菌条件下进行紫外诱变，得到紫外诱变菌株；c1)将步骤b1)得到的紫外诱变菌株用甲基磺酸乙酯进行化学诱变，得到复合诱变菌株；d1)将步骤c1)得到的复合诱变菌株依次接种到代谢底物类似物8-氮鸟嘌呤、8-氮杂腺嘌呤、6-氮杂胸腺嘧啶、DL-蛋氨酸亚砜、玫瑰黄素的基本培养基中进行培养驯化，制得兼具8-氮鸟嘌呤、8-氮杂腺嘌呤、6-氮杂胸腺嘧啶、DL-蛋氨酸亚砜、玫瑰黄素的抗性突变株；e1)将经过上述步骤处理得到的菌株接种到营养培养基中进行培养，得到的营养培养物接种到菌株发酵培养基中进行培养，筛选出生产维生素B2最高的菌株，即为所述的菌株Bacillussubtilis15-1-11。作为进一步优选方案，步骤a1)中，平板培养基为：酵母粉4.5-5.5g/L，氯化钠9.5-10.5g/L，胰蛋白胨9.5-10.5g/L，琼脂粉17.5-18.5g/L，pH7.0；培养温度均匀为37℃，培养时间为24-36小时。作为进一步优选方案，步骤b1)中，紫外诱变时间为30-60s，诱变高度为40-80cm。作为进一步优选方案，步骤c1)中，甲基磺酸乙酯诱变剂量为0.05-0.5mol/L，诱变时间为20-60分钟。作为进一步优选方案，步骤d1)中，代谢底物类似物的浓度为10-100mg/L，具体驯化操作如下：首先将经过紫外诱变、化学诱变后得到的复合诱变菌株的菌液涂布在含有10-100mg/L8-氮鸟嘌呤的基本培养基中，在37℃培养5-10天，选出8-氮鸟嘌呤抗性突变株；接着将筛选出的8-氮鸟嘌呤抗性突变株的菌液涂布在含有10-100mg/L8-氮杂腺嘌呤的基本培养基中，在37℃培养5-10天；按照上述方法接菌培养6-氮杂胸腺嘧啶抗性突变株、DL-蛋氨酸亚砜抗性突变株、玫瑰黄素抗性突变株，最终得到兼具8-氮鸟嘌呤、8-氮杂腺嘌呤、6-氮杂胸腺嘧啶、DL-蛋氨酸亚砜、玫瑰黄素的抗性突变株。作为进一步优选方案，步骤d1)中，基本培养基为：葡萄糖4.5-5.5g/L，硫酸铵0.15-0.25g/L，磷酸氢二钾1.5-2g/L，磷酸二氢钾0.5-0.7g/L，柠檬酸钠0.1-0.3g/L，色氨酸0.04-0.06g/L，琼脂粉15-17g/L，pH7.0；培养温度均匀为37℃，培养时间为24-48小时。作为进一步优选方案，步骤e1)中，营养培养基为：葡萄糖9.5-10.5g/L，蛋白胨9.5-10.5g/L，酵母抽取物4.5-5.5g/L，牛肉膏4.5-5.5g/L，氯化镁3.5-4.5g/L，琼脂15-17g/L，pH7.2；培养温度均匀为37℃，培养时间为24-48小时。作为进一步优选方案，步骤e1)中，菌株发酵培养基为：葡萄糖80-90g/L，酵母粉8-15g/L，酵母抽取物4.5-5.5g/L，柠檬酸钠4.5-5.5g/L，七水硫酸镁0.4-0.6g/L，磷酸氢二钾0.5-1.5g/L，磷酸二氢钾0.4-0.6g/L，pH7.0；培养温度均匀为37℃，培养时间为48-72小时。作为优选方案，步骤a)中，斜面培养时采用斜面培养基为：胰蛋白胨8-12g/L，酵母抽取物4.5-5.5g/L，氯化钠8-12g/L，琼脂14.5-15.5g/L，红霉素0.01g/L，氯霉素0.035-0.045g/L，卡那霉素0.035-0.045g/L。作为优选方案，步骤b)中，种子培养基为：葡萄糖19-21g/L，酵母抽取物4.5-5.5g/L，硝酸钠4.5-5.5g/L，硝酸铵4.5-5.5g/L，磷酸二氢钾0.9-1.1g/L，磷酸氢二钾2.5-3.5g/L，七水合硫酸镁1-2g/L，氯化亚铁0.01-0.03g/L，硫酸锌0.02-0.04g/L，氯化锰0.01-0.03g/L，红霉素0.01g/L，氯霉素0.035-0.045g/L，卡那霉素0.035-0.045g/L。作为优选方案，步骤c)中，发酵罐中的发酵培养基为：葡萄糖110-130g/L，酵母抽取物8-12g/L，硝酸钠14.5-15.5g/L，硝酸铵4.5-5.5g/L，磷酸二氢钾本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用枯草芽孢杆菌发酵生产维生素B2的方法，其特征在于：包括如下步骤：a)菌株活化：将枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 15‑1‑11先转斜面在37℃培养箱中培养24‑32h，准备移种；b)种子培养：将活化后的菌株以5％的接种量接入种子培养基中进摇瓶培养12‑16h，培养温度40℃，转速240rpm，制得种子培养液；c)发酵培养：将种子培养液接入发酵罐中发酵培养基培养48‑60h，发酵温度为38‑40℃，以30％(v/v)NH4OH和1M H2SO4控制pH为6.7～6.9，控制通气比为0.8，使溶氧量达到20‑30％，转速600rpm；d)维生素B2提取：发酵结束后，发酵液离心后取上清，即得维生素B2，检测发酵液中维生素B2的含量。

【技术特征摘要】
1.一种利用枯草芽孢杆菌发酵生产维生素B2的方法，其特征在于：包括如下步骤：a)菌株活化：将枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis15-1-11先转斜面在37℃培养箱中培养24-32h，准备移种；b)种子培养：将活化后的菌株以5％的接种量接入种子培养基中进摇瓶培养12-16h，培养温度40℃，转速240rpm，制得种子培养液；c)发酵培养：将种子培养液接入发酵罐中发酵培养基培养48-60h，发酵温度为38-40℃，以30％(v/v)NH4OH和1MH2SO4控制pH为6.7～6.9，控制通气比为0.8，使溶氧量达到20-30％，转速600rpm；d)维生素B2提取：发酵结束后，发酵液离心后取上清，即得维生素B2，检测发酵液中维生素B2的含量。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis15-1-11的制备，包括如下步骤：a1)原始菌株的预处理：将枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)原始菌株(例如枯草芽孢杆菌168)涂布于平板培养基上进行培养，培养得到的平板用蒸馏水进行洗吹，得到枯草芽孢杆菌原始菌株的菌液；b1)将步骤a1)得到的菌液在无菌条件下进行紫外诱变，得到紫外诱变菌株；c1)将步骤b1)得到的紫外诱变菌株用甲基磺酸乙酯进行化学诱变，得到复合诱变菌株；d1)将步骤c1)得到的复合诱变菌株依次接种到代谢底物类似物8-氮鸟嘌呤、8-氮杂腺嘌呤、6-氮杂胸腺嘧啶、DL-蛋氨酸亚砜、玫瑰黄素的基本培养基中进行培养驯化，制得兼具8-氮鸟嘌呤、8-氮杂腺嘌呤、6-氮杂胸腺嘧啶、DL-蛋氨酸亚砜、玫瑰黄素的抗性突变株；e1)将经过上述步骤处理得到的菌株接种到营养培养基中进行培养，得到的营养培养物接种到菌株发酵培养基中进行培养，筛选出生产维生素B2最高的菌株，即为所述的菌株Bacillussubtilis15-1-11。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤a1)中，平板培养基为：酵母粉4.5-5.5g/L，氯化钠9.5-10.5g/L，胰蛋白胨9.5-10.5g/L，琼脂粉17.5-18.5g/L，pH7.0；培养温度均匀为37℃，培养时间为24-36小时。4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤b1)中，紫外诱变时间为30-60s，诱变高度为40-80cm。5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤c1)中，甲基磺酸乙酯诱变剂量为0.05-0.5mol/L，诱变时间为20-60分钟。6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤d1)中，代谢底物类似物的浓度为10-100mg/L，具体驯化操作如下：首先将经过紫外诱变、化学诱变后得到的复合诱变菌株的菌液涂布在含有10-100mg/L8-氮鸟嘌呤的基本培养基中，在37℃培养5-10天，选出8-氮鸟嘌呤抗性突变株；接着将...

【专利技术属性】
技术研发人员：张国银，邵兰英，
申请(专利权)人：上海希迈医药科技有限公司，赤峰蒙广生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31