人FSH的重组表达载体、重组细胞株及重组人FSH的制备方法技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，特别涉及人FSH的重组表达载体、重组细胞株及重组人FSH的制备方法。本发明专利技术提供的表达载体为分泌型表达载体，与宿主细胞基因组的整合效率较高，包含该重组表达载体的重组细胞株分泌表达FSH蛋白的效率也较高，其分泌效率大于10pg/细胞/天；另外，本发明专利技术重组表达载体采用一个启动子同时诱导FSH基因和筛选标记基因转录、并使用IRES启动后者翻译的方式，使得细胞耐药性和表达量高度统一，因此，当使用该重组表达载体转染宿主细胞时，筛选出阳性表达细胞株的概率较大，所得重组表达细胞株在筛选条件下可持续、稳定表达FSH蛋白，细胞系经多次传代后，仍能高效表达FSH蛋白。

Recombinant expression vector of human FSH, recombinant cell line and preparation method of recombinant human FSH

The invention relates to the field of biotechnology, in particular the preparation methods of recombinant expression vector of human FSH, recombinant cell line and recombinant human FSH. The expression vector for secretory expression vector with high efficiency, integration of the genome of the host cell, the recombinant cells containing the recombinant expression vector of FSH protein expression and secretion efficiency is higher, the secretion efficiency of more than 10pg/ cells / day; in addition, the carrier adopts a promoter and induce FSH gene and marker gene use IRES to start the transcription and translation of the recombinant expression, so that the cell drug resistance and expression of unity, therefore, when using the recombinant expression vector was transfected into the host cell, screened positive cells for greater probability, the recombinant protein expression of FSH cells in the condition of stable sustainable, screening, cell the department after the subculture, still efficient expression of FSH protein.

【技术实现步骤摘要】
人FSH的重组表达载体、重组细胞株及重组人FSH的制备方法
本专利技术涉及生物
，特别涉及人FSH的重组表达载体、重组细胞株及重组人FSH的制备方法。
技术介绍
促卵泡激素(FSH)是一种由脑垂体合成并分泌的激素，属于糖基化蛋白质激素，因最早发现其对女性卵泡成熟的促进作用而得名。后来的研究表明，促卵泡激素在男女两性体内都是很重要的激素之一，调控着发育、生长、青春期性成熟、以及生殖相关的一系列生理过程。促卵泡激素和黄体生成素在生殖相关的生理过程中协同发挥着至关重要的作用。促卵泡激素(FSH)，分子量约为42kDa，由二个非共价结合的具有高度亲和力的多肽亚单位组成。在一定条件下，FSH可解离为α亚单位和β亚单位。FSH的α亚单位与其他促性腺激素具有相同的氨基酸序列，而β亚单位的氨基酸序列却是FSH所特有的与之不同，具决定FSH有独特的生物学及免疫学活性。因此，FSH所呈现的活性形式是由β亚单位所决定的。FSH按来源不同分为三大类，第一类从绝经妇女的尿液中提取出来的尿源促卵泡激素；第二类是从下丘脑垂体中纯化得到的垂体促卵泡激素；第三类是通过DNA重组技术，用真核细胞表达的重组人促卵泡激素(rhFSH)。人促卵泡激素最初是从垂体腺细胞中提取获得，但因为人脑组织极不容易获得，所以无法用于药品。后来在1993年经由绝经妇女尿液提取的尿源促卵泡激素作为药品上市，用于辅助治疗不孕不育(u-FSHHP，商品名：Metrodin-HP，Serno)。但尿源促卵泡激素一般含有黄体生成素(LH)杂质，并且杂质含量越高药品副作用越大。由于黄体生成素和促卵泡激素的蛋白性质高度相似，尿源促卵泡激素很难去除黄体生成素或控制其含量。再加上尿源质量难以控制，尿源蛋白本身生物活性不高，纯化工艺难度大，尿源促卵泡激素一直存在着批间差大、质量不稳定的问题。1998年瑞士Serno公司首先推出了重组人促卵泡激素。后来2004年荷兰Organon公司也推出了重组人促卵泡激素。重组人促卵泡素(rhFSH)通过基因工程方法构造出可以持续分泌表达重组人促卵泡素的中国仓鼠卵巢细胞(CHO)细胞系，并通过大规模发酵培养这种细胞生产重组人促卵泡素。由于用于生产重组人促卵泡素的细胞系具有良好的均一性，细胞发酵工艺高度可控，而且工艺流程中完全不含有尿源中黄体生成素(LH)，大大提高了药品质量，降低了副作用，提高了安全性。国内厂家促卵泡激素已上市的产品，除2015年长春金赛推出的重组促卵泡激素外均为尿源产品，且目前国内产品市场占有率较高的是丽珠制药所生产的尿源产品。丽珠集团在2005年推出之后增势迅猛，进口尿源产品Metrodin-HP在2009年之后完全退出该市场。近几年伊伯萨(IBSA)的尿促卵泡素抢占了部分丽珠的份额。2015年长春金赛新推出的重组产品目前市场状况未知。在设计和构造重组人FSH细胞系时，能正确的表达FSHα和β两条多肽，并使它们形成正确的异源二聚体是构造其细胞系的核心和技术难点。一般生产重组异源二聚体蛋白的方法有如下几种：1)构建两条细胞株分别表达α和β两条多肽并在细胞外使它们形成异源二聚体。理论上这种方法通过单独表达和纯化α和β两条多肽，能精准的调整它们的摩尔比例，有可能在质控条件下使它们形成异源二聚体。但因为分开表达的蛋白一般不能正确折叠，或者稳定性不佳，所以在现实中这种方法一般难以实现。2)在细胞的基因组中同时插入两个表达载体或在同一载体中使用两个启动子分别表达α和β两个亚基。使用这种方法α和β两个亚基将在同一个细胞内表达，并通过宿主细胞内的辅助蛋白形成正确的异源二聚体。目前已经上市的重组促卵泡激素药物都是使用这种方法生产的。但是因为这种方法使用两个启动子分别表达α和β两个亚基，难以控制两个亚基在细胞内的表达量的完全一致，并且在构建时如果使用两个质粒，会进一步降低细胞的稳定性甚至出现单一链不表达的情况。在生产时，表达量高的亚基不能形成异源二聚体，游离在样品原液中，因其性质相似不容易通过纯化手段去除，影响药品质量。3)通过使用内部核糖体进入位点(internalribosomeentrysite，IRES)序列构建单一载体，使α和β两个亚基受同一个启动子控制在共同转录在同一个mRNA分子上，并通过IRES片段启动翻译第二个蛋白。但IRES序列本身的生物学特性使得它在启动翻译mRNA第二个蛋白的效率要远低于第一个蛋白。已发表的文献测得第二个蛋白的翻译效率只有第一个蛋白的20％。4)使α和β两个亚基以融合蛋白的形式表达。这种方法解决了其它方法α和β两个亚基表达不均匀的问题，也能大量表达有生物活性的促卵泡激素。但主要问题是连接两个亚基的连接蛋白序列(linker)通常具有免疫源性。在进入人体内后，人可能产生针对此段链接序列的中和抗体，并最终产生耐药性，影响药品的重复使用。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术要解决的技术问题在于提供一种人FSH的重组表达载体、重组细胞株及重组人FSH的制备方法，本专利技术提供的重组人促卵泡激素(rhFSH)表达载体为分泌型表达载体，该载体进入细胞可稳定、高效表达具有天然活性的重组人FSH。本专利技术提供了一种表达人FSH的重组表达载体，包括以下元件：启动子、β球蛋白基因内含子、alpha链的分泌信号肽、人FSHα基因、自体切割肽序列、beta链的分泌信号肽、人FSHβ基因、内部核糖体进入位点序列和筛选标记基因；所述自体切割肽序列包括蛋白切割酶furin识别位点和2A序列。本专利技术实施例中，所述启动子为CMV启动子、PGK启动子、RSV启动子或SV40启动子；所述alpha链的分泌信号肽为signalHMM34分泌信号肽、人或鼠Igkappa链分泌信号肽或人白介素2的分泌信号肽；所述beta链的分泌信号肽为signalCystatinS分泌信号肽、人或鼠Igkappa链分泌信号肽或人白介素2的分泌信号肽；所述2A序列为P2A序列、E2A序列、F2A序列或T2A序列。所述筛选标记基因为二氢叶酸还原酶基因、谷氨酰胺合成酶基因、新霉素抗性基因、博来霉素抗性基因或潮霉素抗性基因。一些具体实施例中，所述自体切割肽序列如SEQIDNo.4所示，包括蛋白切割酶furin识别位点和P2A序列。一些具体实施例中，所述alpha链的分泌信号肽为signalHMM34分泌信号肽，序列如SEQIDNo.2所示；所述人FSHα基因序列如SEQIDNo.3所示；所述beta链的分泌信号肽为signalCystatinS分泌信号肽，序列如SEQIDNo.5所示；所述人FSHβ基因序列如SEQIDNo.6所示。一些具体实施例中，所述启动子为CMV启动子；所述β球蛋白基因内含子序列如SEQIDNo.1所示，所述内部核糖体进入位点序列如SEQIDNo.7所示。所述筛选标记基因为二氢叶酸还原酶基因。一些具体实施例中，所述元件的连接顺序为：启动子—β球蛋白基因内含子—alpha链的分泌信号肽—人FSHα基因—自体切割肽序列(furin-P2A)—beta链的分泌信号肽—人FSHβ基因—内部核糖体进入位点序列—筛选标记基因；或启动子—β球蛋白基因内含子—beta链的分泌信号肽—人FSHβ基因—自体切割肽序列(furin-P2A)—alpha链的分泌信号肽—人本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种表达人FSH的重组表达载体，其特征在于，包括以下元件：启动子、β球蛋白基因内含子、alpha链的分泌信号肽、人FSHα基因、自体切割肽序列、beta链的分泌信号肽、人FSHβ基因、内部核糖体进入位点序列和筛选标记基因；所述自体切割肽序列包括蛋白切割酶furin识别位点和2A序列。

【技术特征摘要】
1.一种表达人FSH的重组表达载体，其特征在于，包括以下元件：启动子、β球蛋白基因内含子、alpha链的分泌信号肽、人FSHα基因、自体切割肽序列、beta链的分泌信号肽、人FSHβ基因、内部核糖体进入位点序列和筛选标记基因；所述自体切割肽序列包括蛋白切割酶furin识别位点和2A序列。2.根据权利要求1所述的重组表达载体，其特征在于，所述启动子为CMV启动子、PGK启动子、RSV启动子或SV40启动子；所述alpha链的分泌信号肽为signalHMM34分泌信号肽、人或鼠Igkappa链分泌信号肽或人白介素2的分泌信号肽；所述beta链的分泌信号肽为signalCystatinS分泌信号肽、人或鼠Igkappa链分泌信号肽或人白介素2的分泌信号肽；所述2A序列为P2A序列、E2A序列、F2A序列或T2A序列；所述筛选标记基因为二氢叶酸还原酶基因、人谷氨酰胺合成酶基因、新霉素抗性基因、博来霉素抗性基因或潮霉素抗性基因。3.根据权利要求1所述的重组表达载体，其特征在于，所述自体切割肽序列如SEQIDNo.4所示，包括蛋白切割酶furin识别位点和P2A序列。4.根据权利要求1所述的重组表达载体，其特征在于，所述alpha链的分泌信号肽为signalHMM34分泌信号肽，序列如SEQIDNo.2所示；所述人FSHα基因序列如SEQIDNo.3所示；所述beta链的分泌信号肽为signalCystatinS分泌信号肽，序列如SEQIDNo.5所示；所述人FSHβ基因序列如SEQID...

【专利技术属性】
技术研发人员：薛博夫，马墨，李盼姣，白孟飞，
申请(专利权)人：深圳市港科深研生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44