基于转座酶建立过表达稳定系的质粒载体及其应用制造技术

本发明专利技术公开一系列基于转座酶建立过表达稳定系的质粒载体及其应用。该质粒载体是含有IRDR‑L‑IRDR‑R盒的双链环状质粒，所述IRDR‑L‑IRDR‑R盒包括IRDR‑L序列、启动子、标签序列、attR1序列、反向选择性标记基因序列ccdB、attR2序列、筛选基因序列和IRDR‑R序列；所述的标签为HA标签、Myc标签、Flag标签或V5标签。本发明专利技术的质粒载体带有Sleeping Beauty转座子末端反向重复序列和Gateway Cassette序列，基于转座酶的方法能快速高效构建过表达稳定系，且带有各种不同的标签序列Tag和带有筛选基因GFP，能满足常规的在真核细胞中表达目的基因的需要。

Plasmid vector and its application based on transposes for the establishment of overexpressed stable lines

The invention discloses a series of plasmid vectors and their applications based on transposable enzyme to establish an over expression stable line. The plasmid is double stranded plasmid containing IRDR L IRDR R box, the IRDR L IRDR R IRDR box includes L sequence, promoter, tag sequence, attR1 sequence, reverse selective marker gene sequence, attR2 sequence, ccdB sequence and IRDR gene screening R sequence; the the label of HA label, Myc label, Flag label or V5 label. The invention of the Sleeping plasmid with Beauty transposon inverted terminal repeat sequence and Gateway Cassette sequence, transposase method can quickly and efficiently construct stable expression system based on, and with the Tag tag sequences different with GFP gene and screening, can meet the normal needs of target gene expression in eukaryotic cells.

【技术实现步骤摘要】
基于转座酶建立过表达稳定系的质粒载体及其应用
本专利技术属于基因工程领域，具体的说，本专利技术涉及到运用Gateway克隆技术构建质粒载体，该一系列质粒载体带有不同的标签序列和筛选基因GFP，通过转座子系统将目的基因整合到细胞基因组，实现基因的转移。特别涉及一种基于转座酶建立过表达稳定系的质粒载体及其应用
技术介绍
过表达稳定细胞株是指外源DNA整合到宿主细胞基因组中，可使宿主细胞长期表达目的基因，与瞬转株相比，稳定细胞株能够很大程度上的方便实验研究和降低实验成本。因此，构建基因过表达稳定株在基因功能与机制的研究中被广泛应用。目前构建稳定细胞株主要是通过病毒包装、感染目的细胞的方式来实现的，这种方法耗时长，通常需要两个星期左右。此外，由于所插入的目的基因片段大小受到病毒质粒自身大小的限制，通常目的基因片段大小不能超过3Kb，并且操作人员有感染病毒的潜在安全隐患。与此同时，过表达质粒载体通常采用插入到多克隆位点的方法构建，这种方法不仅效率较低，并且消耗时间长，极大地影响了科研人员的实验进程。转座子(Transposon)最早是由McClintock于20世纪50年代在研究玉米籽粒的颜色变异中发现的一类不依靠同源重组而能在基因组内和基因组间发生位置改变的DNA序列，因此也被称为跳跃基因或者可移动元件。DNA转座子是其中一种转座机制类型，目前使用较为广泛的DNA转座子类型是SleepingBeauty转座子。首个有活性的SleepingBeauty转座子是通过对鱼类基因组中多个失活的Tc1/mariner转座子进行分子重建产生的，该转座子能够插入到AT二碱基区域，并具有插入至内含子中的倾向。此后，为了进一步提高SleepingBeauty的转座活性，研究人员通过对SleepingBeauty转座酶基因氨基酸突变的方法对其酶活性进行了广泛的筛选，最终获得了活性增加100倍的SleepingBeauty突变体(SB100X))。经过改良后的SleepingBeauty转座子采用“剪切-粘贴”的转座机制，具体的说是：在细胞中，转座酶SB100X识别SleepingBeauty转座子两端特异的反向重复序列(ITRS)，并将转座子序列切出，然后通过DNA攻击的方式插入新的基因组位置。这种SleepingBeauty转座子的优点是：构建稳定株不需要包装病毒，大大的缩短了稳定株构建的时间，避免了包装病毒过程中所产生的生物安全问题；同时插入的目的片段大小不受限制；稳定重组效率高。Gateway克隆技术是由Invitrogen公司开发的一项基因克隆新技术，该技术利用位点特异性重组反应：BP反应和LR反应，并利用大肠杆菌自杀基因ccdB，极大地提高了克隆的效率，同时大大的缩短了构建质粒的时间。
技术实现思路
为了克服现有技术的不足，本专利技术的首要目的在于提供一系列基于转座酶快速建立过表达稳定系的质粒载体。本专利技术的另一目的在于满足常规的在真核细胞中表达目的基因的需要，本专利技术提供的一系列质粒载体中带有Flag、HA、V5或Myc标签序列，这些标签序列的存在使目的基因的Western、免疫荧光、ELISA等的检测通过Flag、HA、V5或Myc抗体即可进行，节省了购买抗体或自行制备抗体的费用和时间，对于进行IP或co-IP也带来了很大的便利。同时本专利技术提供的一系列质粒载体分为带有筛选基因GFP和不带筛选基因GFP两类，方便流式实验筛选出阳性细胞，同时也可以验证质粒转染的效率。该质粒载体包括SleepingBeauty转座子元件(ITRS)，强启动子CAG驱动的ccdB基因元件，ccdB基因元件两侧分别含有重组位点attR1和attR2，在重组位点attR1的上游带有不同标签序列。同时该系列质粒载体分为带有筛选基因GFP和不带筛选基因GFP两类。通过GatewayLR反应生成含带有SleepingBeauty转座子作用元件(ITRS)，不同标签序列和筛选基因GFP的质粒载体。同时采用该系统能够很好地将目的基因整合到受体基因组中，实现基因的转移。本专利技术提供以pSM1.1-HA-Puro-GFP为基础，构建用于基因功能与机制研究的一系列质粒载体。本方法融合了转座子和Gateway克隆技术的优点，可简单高效地用于构建过表达稳定株。本专利技术的另一目的在于提供上述质粒载体的应用。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：本专利技术提供一系列基于转座酶建立过表达稳定系的质粒载体，是含有IRDR-L-IRDR-R盒的双链环状质粒，所述IRDR-L-IRDR-R盒包括IRDR-L序列、启动子、标签序列、attR1序列、反向选择性标记基因序列、attR2序列、筛选基因序列和IRDR-R序列。所述的IRDR-L序列为SEQIDNO.1中自5′端第8877位～9103位碱基的反向互补序列；所述的IRDR-R序列为SEQIDNO.1中自5′端第5731位～5958位碱基。所述的启动子为CAG启动子，其序列为SEQIDNO.1中自5′端第1位～1132位碱基。所述的标签序列为HA标签序列、Myc标签序列、Flag标签序列或V5标签序列。所述的HA标签序列为SEQIDNO.1中自5′端第1172位～1201位碱基。所述的Myc标签序列为SEQIDNO.2所示。所述的Flag标签序列为SEQIDNO.3所示。所述的V5标签序列为SEQIDNO.4所示。所述的attR1序列为SEQIDNO.1中自5′端第1211位～1335位碱基；所述的attR2序列为SEQIDNO.1中自5′端第2791位～2915位碱基的反向互补序列。所述的反向选择性标记基因序列是指自杀基因ccdB，其序列为SEQIDNO.1中自5′端第2445位～2750位碱基。所述的筛选基因为抗性与荧光筛选基因，或抗性筛选基因。所述的抗性筛选基因是指嘌呤霉素(puromycin)抗性基因，其序列为SEQIDNO.1中自5′端第3464位～4063位碱基。所述的荧光筛选基因是指绿色荧光蛋白(GFP)基因，其序列为SEQIDNO.1中自5′端第4704位～5438位碱基。本专利技术首先构建载有SleepingBeauty转座子作用元件，Gatewaycassette-终止子片段，HA标签Tag和GFP筛选基因的pSM1.1-HA-Puro-GFP质粒载体，随后以pSM1.1-HA-Puro-GFP为模板，通过改动标签序列Tag，改造构建分别载有Flag标签序列，Myc标签序列的两个Tag标签序列的质粒pSM1.1-Flag-Puro-GFP和pSM1.1-Myc-Puro-GFP。随后分别以它们三个质粒为模板，构建了去掉筛选基因GFP的质粒，分别是pSM1.1-Flag-Puro，pSM1.1-HA-Puro和pSM1.1-Myc-Puro。最后以pSM1.1-Flag-Puro为模板，通过改动标签序列Tag，改造构建载有V5标签序列的pSM1.1-V5-Puro。该系列质粒的专利技术将使得构建稳定株和质粒载体更加高效便利，同时满足各种常规的在真核细胞中表达目的基因的需要。构建7个质粒载体测序结果见序列表。本专利技术一系列质粒中的pSM1.1-HA-Puro-GFP，具有SEQIDNO.1所示的核苷酸序列。所述pSM1.1-HA-Pu本文档来自技高网...

【技术保护点】
基于转座酶建立过表达稳定系的质粒载体，其特征在于：所述的质粒载体是含有IRDR‑L‑IRDR‑R盒的双链环状质粒，所述IRDR‑L‑IRDR‑R盒包括IRDR‑L序列、启动子、标签序列、attR1序列、反向选择性标记基因序列、attR2序列、筛选基因序列和IRDR‑R序列；所述的标签序列为HA标签序列、Myc标签序列、Flag标签序列或V5标签序列。

【技术特征摘要】
1.基于转座酶建立过表达稳定系的质粒载体，其特征在于：所述的质粒载体是含有IRDR-L-IRDR-R盒的双链环状质粒，所述IRDR-L-IRDR-R盒包括IRDR-L序列、启动子、标签序列、attR1序列、反向选择性标记基因序列、attR2序列、筛选基因序列和IRDR-R序列；所述的标签序列为HA标签序列、Myc标签序列、Flag标签序列或V5标签序列。2.根据权利要求1所述的基于转座酶建立过表达稳定系的质粒载体，其特征在于：所述的IRDR-L序列为SEQIDNO.1中自5′端第8877位～9103位碱基的反向互补序列；所述的IRDR-R序列为SEQIDNO.1中自5′端第5731位～5958位碱基。3.根据权利要求1所述的基于转座酶建立过表达稳定系的质粒载体，其特征在于：所述的启动子为CAG启动子。4.根据权利要求1所述的基于转座酶建立过表达稳定系的质粒载体，其特征在于：所述的HA标签序列为SEQIDNO.1中自5′端第1172位～1201位碱基；所述的Myc标签序列为SEQIDNO.2所示；所述的Flag标签序列为SEQIDNO.3所示；所述的V5标签序列为SEQID...

【专利技术属性】
技术研发人员：尹东，胡开顺，陈恒星，李瑜，
申请(专利权)人：中山大学孙逸仙纪念医院，
类型：发明
国别省市：广东,44