PD‑1和CTLA4双基因缺陷型T淋巴细胞制剂的制备方法技术

本发明专利技术属于分子生物学技术领域，具体涉及一种PD‑1和CTLA4双基因缺陷型T淋巴细胞制剂的制备方法。PD‑1和CTLA4双基因敲除载体的构建，T淋巴细胞分离与激活，电转染T淋巴细胞及T7E1酶切鉴定，流式细胞仪筛选与测序分析。本发明专利技术的基因缺陷型免疫细胞制剂的生产，一方面简化了细胞的生产程序，另一方面提升了T淋巴细胞杀灭肿瘤细胞的能力，并能增强长期肿瘤免疫。

PD 1 and CTLA4 gene deficient T lymphocyte and its preparation method

The invention belongs to the technical field of molecular biology, in particular to a method for preparing PD 1 and CTLA4 gene deficient T lymphocyte preparations. PD 1 and CTLA4 double knockout vector, T lymphocyte isolation and activation of T lymphocytes and T7E1 by enzyme digestion and sequencing, flow cytometry analysis screening. The production of the gene deficient immune cell preparation on the one hand simplifies the production procedure of the cell, on the other hand improves the ability of T lymphocytes to kill tumor cells, and can enhance the long-term tumor immunity.

【技术实现步骤摘要】
PD-1和CTLA4双基因缺陷型T淋巴细胞制剂的制备方法
本专利技术属于分子生物学
，具体涉及一种PD-1和CTLA4双基因缺陷型T淋巴细胞制剂的制备方法。
技术介绍
T细胞主要识别由细胞表面主要组织相容性复合物(MHC)提呈的抗原肽。大多数情况下，T细胞表面抗原受体(TCR)信号转导可以活化抗原激活的T细胞，然而，仅仅依靠TCR信号转导途径难以触发T细胞免疫应答。因此，T细胞的有效活化和功能介导需要双重信号的协同作用：一是抗原肽-MHC复合物，由T细胞抗原受体(TCR)识别；二是协同刺激信号，由抗原递呈细胞(APC)和T细胞表面的协同刺激分子配体和受体对提供。其中，PD-1/PD-L1是公认的最基本的协同刺激信号，由表达在T细胞上的PD-1和表达在抗原递呈细胞表面的PD-L1和PD-L2相互作用产生。PD-1(programmeddeath-1)，又称为PDCDl、CD279，是CD28免疫球蛋白超家族中的一员，它是在诱导T细胞杂交瘤发生凋亡时发现并命名的，主要表达在外周循环T细胞、自然杀伤细胞(NKT)，B细胞和单核细胞上。PD-1分子有两个配体PD-L1(又称CD274)和PD-L2(又称CD273)，它们均为B7家族成员。PD-1与其配体PD-L1相结合可对机体免疫系统起负性调节作用。肿瘤免疫应答早期，循环免疫细胞T细胞可以识别、浸润继而清除某些癌细胞，然而，一些癌细胞可以通过某些方式逃过免疫监视和免疫系统介导的细胞死亡。研究表明，共刺激分子PD-1，与其配体PD-L1相互作用可以降低免疫应答的强度和持续时间，这为癌细胞的免疫逃逸提供了有利条件。体外研究表明阻断PD-1/PD-L1途径可以增强T细胞免疫效能，调节机体抗肿瘤免疫应答。目前认为共刺激分子及其调节途径在癌细胞抗肿瘤免疫过程中发挥了极其重要的作用。阻断PD-1/PD-L1通路能有效促进肿瘤特异性CD8+T细胞对肿瘤组织的浸润，分泌大量肿瘤杀伤因子，从而抑制肿瘤的生长。细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)又称CD125分子，是一种免疫调节分子，是B7分子配体，属于免疫球蛋白超家族的抑制分子，其结合后诱导T细胞参与免疫反应负调节，即诱导T细胞无反应，使T细胞的细胞周期停滞于Gl期等，抑制T淋巴细胞的增殖和功能。研究表明，用抗体阻断CTLA4功能可显著增加T淋巴细胞的激活。抗肿瘤T淋巴细胞在机体对恶性肿瘤的免疫监视中起关键作用。实验显示，给移植了肿瘤的小鼠注射抗CTLA4抗体可抵制多种类型的肿瘤并可长期保持抗肿瘤免疫。临床研究表明阻断CTLA4可使肿瘤缩小。这些资料都表明CTLA4在肿瘤的发生发展中起重要作用。因此，采用CRISPR/Cas9技术敲除T淋巴细胞中的PD-1基因，从而激活T淋巴细胞对肿瘤细胞攻击的能力，实现肿瘤的免疫治疗，敲除CTLA4更有利于T淋巴细胞的激活，并能使细胞获得长期的抗肿瘤免疫，双缺陷基因的T淋巴细胞更具有杀灭肿瘤细胞的能力。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种PD-1和CTLA4双基因缺陷型T淋巴细胞制剂的制备方法，简化了细胞的生产程序、提升了T淋巴细胞攻击肿瘤细胞的能力，并能增强长期肿瘤免疫。本专利技术所述的PD-1和CTLA4双基因缺陷型T淋巴细胞制剂的制备方法，步骤如下：(1)PD-1和CTLA4双基因敲除载体的构建根据PD-1和CTLA4全基因序列(外显子区)分别设计gRNAtarget序列，然后将两个gRNAtarget序列克隆进表达载体，获得带有两个不同target序列gRNA的敲除载体；两个gRNAtarget序列分别为5’-CCGAGCCTACCATATGGTGT-3’和5’-CCGCTGCCAGAGATCCCAAA-3’；(2)T淋巴细胞分离与激活T淋巴细胞分离，培养，激活，繁殖，收集；(3)电转染T淋巴细胞及T7E1酶切鉴定T淋巴细胞中加入电转液和步骤(1)得到的敲除载体进行电转染，电转染结束后，继续培养，收集细胞提取基因组，采用T7E1酶切鉴定；(4)流式细胞仪筛选与测序分析电转染结束后收集的细胞采用流式细胞仪进行分离得到单克隆细胞，单克隆细胞扩大培养，即得PD-1和CTLA4双基因缺陷型T淋巴细胞制剂；扩大培养后的单克隆细胞提取基因组进行测序分析。步骤(1)中所述的表达载体为pU6gRNA-Cas9-GFP表达载体。步骤(3)中所述的电转液组成如下，以体积百分比计：无钙镁PBS90％无血清培养基RPMI164010％；以无钙镁PBS和无血清培养基RPMI1640的总体积为100％计，EDTA加入量为30g/L，蔗糖加入量为200mmol/L。电转液的制备方法是将无钙镁PBS与无血清培养基RPMI1640混合，然后加入EDTA和蔗糖，溶解后再过滤除菌。步骤(3)中所述的继续培养时间为48h。步骤(4)中流式细胞仪筛选方法是细胞转染48h后，用PBS清洗细胞两次，经流式细胞仪筛选GFP阳性单克隆T淋巴细胞，而后扩大繁殖培养，提取基因组，进行PCR后连接T载体，转化大肠杆菌感受态进行测序分析，筛选PD-1与CTLA4基因均发生移码突变的T淋巴细胞(由单克隆细胞繁殖而成)，即获得新型免疫细胞制剂。本专利技术构建特异的、高效的双基因敲除载体，高效的电转染方法，流式细胞仪筛选单克隆细胞后，筛选双基因缺陷型T淋巴细胞，扩繁获得可用于肿瘤治疗与预防的免疫细胞制剂。两个gRNA均属于独立表达单元，载体还包含Cas9基因和绿色荧光蛋白(GFP)基因。双基因敲除载体经电转染T淋巴细胞后，利用流式细胞仪筛选GFP阳性单克隆细胞，最终获得双基因缺陷型T淋巴细胞，具备用于肿瘤预防与治疗的免疫细胞条件。流式细胞仪筛选的PD-1和CTLA4基因缺陷型T淋巴细胞为一免疫细胞制剂，可用于人体回输预防或治疗肿瘤。本专利技术利用生物信息学技术获得特异性、高效识别靶位点并有效切断靶位点的gRNAtarget序列，而后将序列克隆进pU6gRNA-Cas9-GFP表达载体，构建成功可以同时表达两个带有不同target序列gRNA的表达载体。本专利技术在构建gRNA与Cas9表达载体的基础上，利用电转染技术将表达载体转入活化的T淋巴细胞，电转染采用优化的电转染缓冲液，转化效率高，细胞死亡率低，更有效获得PD-1和CTLA4双基因缺陷型T淋巴细胞。本专利技术的有益效果如下：本专利技术首先确定了能够实现高效敲除PD-1和CTLA4基因的两个gRNAtarget序列，而后优化电转染缓冲液，实现T淋巴细胞的高效电转染和保证电转染后细胞的成活率，最后利用流式细胞仪筛选GFP阳性细胞，分离筛选双基因移码突变的纯合子T淋巴细胞，获得PD-1和CTLA4双基因缺陷细胞。本专利技术的基因缺陷型免疫细胞制剂的生产，一方面简化了细胞的生产程序，另一方面提升了T淋巴细胞杀灭肿瘤细胞的能力，并能增强长期肿瘤免疫。附图说明图1为单PD-1敲除载体示意图。图2为构建双敲除载体所用的中间载体。图3为PD-1和CTLA4双基因敲除载体示意图。图4为激活的T淋巴细胞。图5为电转染48小时后的T7E1酶切鉴定结果。图6为PD-1基因测序结果。图7为CTLA4基因测序结果。图8为PD-1和CTLA4双基因缺陷细胞株的westernblotting图。具体实施方式以下结合实施例对本本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种PD‑1和CTLA4双基因缺陷型T淋巴细胞制剂的制备方法，其特征在于步骤如下：(1)PD‑1和CTLA4双基因敲除载体的构建根据PD‑1和CTLA4全基因序列分别设计gRNA target序列，然后将两个gRNA target序列克隆进表达载体，获得带有两个不同target序列gRNA的敲除载体；两个gRNA target序列分别为5’‑CCGAGCCTACCATATGGTGT‑3’和5’‑CCGCTGCCAGAGATCCCAAA‑3’；(2)T淋巴细胞分离与激活T淋巴细胞分离，培养，激活，繁殖，收集；(3)电转染T淋巴细胞及T7E1酶切鉴定T淋巴细胞中加入电转液和步骤(1)得到的敲除载体进行电转染，电转染结束后，继续培养，收集细胞提取基因组，采用T7E1酶切鉴定；(4)流式细胞仪筛选与测序分析电转染结束后收集的细胞采用流式细胞仪进行分离得到单克隆细胞，单克隆细胞扩大培养，即得PD‑1和CTLA4双基因缺陷型T淋巴细胞制剂；扩大培养后的单克隆细胞提取基因组进行测序分析。

【技术特征摘要】
1.一种PD-1和CTLA4双基因缺陷型T淋巴细胞制剂的制备方法，其特征在于步骤如下：(1)PD-1和CTLA4双基因敲除载体的构建根据PD-1和CTLA4全基因序列分别设计gRNAtarget序列，然后将两个gRNAtarget序列克隆进表达载体，获得带有两个不同target序列gRNA的敲除载体；两个gRNAtarget序列分别为5’-CCGAGCCTACCATATGGTGT-3’和5’-CCGCTGCCAGAGATCCCAAA-3’；(2)T淋巴细胞分离与激活T淋巴细胞分离，培养，激活，繁殖，收集；(3)电转染T淋巴细胞及T7E1酶切鉴定T淋巴细胞中加入电转液和步骤(1)得到的敲除载体进行电转染，电转染结束后，继续培养，收集细胞提取基因组，采用T7E1酶切鉴定；(4)流式细胞仪筛选与测序分析电转染结束后收集的细胞采用流式细胞仪进行分离...

【专利技术属性】
技术研发人员：王清路，
申请(专利权)人：山东百福基因科技有限公司，王清路，
类型：发明
国别省市：山东,37