本发明专利技术涉及一种链霉菌属来源的透明质酸裂解酶HyaL16‑3及其编码基因与应用。所述透明质酸裂解酶HyaL16‑3，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明专利技术所述的透明质酸裂解酶HyaL16‑3以透明质酸或硫酸软骨素为底物时，在50℃、pH6.0条件下具有最高酶活力。HyaL16‑3对透明质酸的比活为10,306U/mg、对硫酸软骨素A的比活为1,640U/mg、对硫酸软骨素C的比活为1,330U/mg。HyaL16‑3可用于专一性制备不饱和透明质酸二糖、不饱和CS‑A二糖、不饱和CS‑C二糖，应用前景广阔。
With the application of a gene from Streptomyces hyaluronate lyase HyaL16 encoding and 3
The invention relates to a source of Streptomyces hyaluronate lyase HyaL16 gene and its encoding and application 3. The hyaluronate lyase HyaL16 3 amino acid sequence is shown as SEQ ID NO.2. The enzyme HyaL16 hyaluronic acid cleavage of the 3 with hyaluronic acid or chondroitin sulfate as substrate, with the highest enzyme activity at 50 DEG C, under the condition of pH6.0. HyaL16 3 of hyaluronic acid, the specific activity of 10306U/mg on chondroitin sulfate A specific activity was 1640U/mg, chondroitin sulfate C specific activity was 1330U/mg. HyaL16 3 can be used for specific preparation of unsaturated hyaluronic acid and two unsaturated CS sugar, sugar, A two C two CS unsaturated sugar, broad application prospects.
【技术实现步骤摘要】
一种链霉菌属来源的透明质酸裂解酶HyaL16-3及其编码基因与应用
本专利技术涉及一种链霉菌属来源的透明质酸裂解酶HyaL16-3及其编码基因与应用，属于生物技术
技术介绍
透明质酸(hyaluronicacid，HA)，又名玻璃酸或玻尿酸，广泛存在于动物的组织细胞间质和某些细菌的荚膜中。1934年，Meyer和Palmer等首先从牛眼玻璃体中分离出该物质[1]。HA是糖胺聚糖中的一种，属于酸性粘多糖，是由D-葡萄糖醛酸和N-乙酰葡糖胺通过β-1,3-糖苷键组成的二糖单元，经β-1,4-糖苷键重复连接而成的线性大分子[2]。由于HA是线性大分子，且分子链中葡萄糖醛酸上的羧基所带的负电荷相互排斥，可使分子呈伸展状态。而且，即使在较低浓度下，HA分子间也有强烈的相互作用，表现为具有较高的粘度，同时具有良好的润滑作用[3]。水溶液中的HA分子链之间可形成疏松的网状结构，水分子在透明质酸网络内通过极性键和氢键与HA分子相结合，不易流失，因此HA具有非常强的吸水能力，是目前最好的保湿材料。作为生物大分子，HA还在生物体内发挥重要生理功能，如润滑关节，调节血管壁的通透性，调节蛋白质、水电解质扩散及运转，促进伤口愈合等[4-6]。除此之外，因其无任何免疫原性和毒性，使得HA在化妆品、食品和医药等行业领域有着众多应用[7]。近年来的研究发现，低分子量的HA和HA寡糖具有更加独特的生物学功能。研究表明，低分子量的HA和HA寡糖，具有抑制肿瘤扩散、促进创伤愈合、促进骨和血管生成、免疫调节等作用，且易于渗透到真皮中，是免疫细胞、细胞因子的激活剂[8]。另外，低分子量的HA和HA寡糖具有更好的抗氧化自由基的作用，可有效修复紫外线造成的细胞损伤，还可以渗透入皮肤表皮层，对皮肤内源性的HA进行补充，从而营养皮肤，延缓衰老。因此，小分子HA在临床医疗、食品保健以及化妆品领域具有广阔的应用前景。目前，小分子HA的制备方法主要有物理降解、化学降解和生物降解。物理降解法难以将HA降解到10kD以下，产生的分子量分步范围广且稳定性差；化学降解法的反应条件剧烈，容易破坏单糖残基的结构[9]，使生物活性降低，且对环境污染严重；生物降解主要是酶法降解，其特点是专一、高效且安全，不但可以制备小分子HA，还可以制备HA寡糖，具有良好的应用前景。透明质酸酶(hyaluronidase)是一类能够催化降解HA的酶的通称，广泛存在于人体组织及体液、细菌、真菌以及非脊椎动物如水蛭、甲壳类动物中。1971年，Meyer根据透明质酸酶作用机制的不同，将其分为3类[10]：(1)内切β-N-乙酰氨基葡糖苷酶(EC3.2.1.35)，为水解酶，作用于β-1,4糖苷键，终产物主要为四糖；这类酶底物谱广，也可作用于软骨素或硫酸软骨素，并有转糖苷酶活性；哺乳动物来源的以及动物毒液来源的属于此类，研究最多的是睾丸、蜂毒以及溶酶体透明质酸酶。(2)内切-β-葡糖苷酸酶(EC3.2.1.36)，作用于β-1,3糖苷键，也是水解酶，主要降解产物是四糖，特异性降解HA；这类酶主要来自水蛭、十二指肠虫等。(3)N-乙酰氨基己糖苷酶，也称为透明质酸裂解酶(hyaluronatelyase,EC4.2.2.1)，作用于β-1,4糖苷键，通过β-消去机制得到4,5-不饱和双糖；这类酶主要来自微生物。目前，HAase被广泛应用于临床，例如，整形、外科手术、眼科、内科、肿瘤治疗、皮肤科及妇科等。经美国FDA认证，透明质酸酶的用途有3种[11]：(1)用于眼科手术中提高麻醉效果，在加快麻醉速度的同时也降低了麻醉持续的时间；(2)皮下灌注液的添加剂，皮下输液主要用于缓解老年病人出现的脱水症状；(3)用于泌尿道造影时促进造影剂的再吸收，尤其是婴儿或儿童静脉注射达不到效果时。链霉菌是放线菌门中种类最多的一个属，广泛存在于土壤中，是丝状的革兰氏阳性细菌，主要通过孢子繁殖，绝大多数链霉菌对人体无害[12,13]。链霉菌是产生各种抗生素的主要来源，源于链霉菌的抗生素包括红霉素、四环素、链霉素、氯霉素、新霉素、制霉菌素、卡那霉素、放线菌酮和两性霉素等[14]，因此，对于链霉菌的已有研究主要集中于菌株产生抗菌活性物质的能力和大小等方面，链霉菌产生的多糖降解酶主要有几丁质酶、木聚糖酶及纤维素酶等[15-17]，而来源于链霉菌属的透明质酸酶只有ZainabH.Elmabrouk等[18]做过相关研究，国内未见相关报道。ZainabH.Elmabrouk等人的研究表明：链霉菌属来源的透明质酸酶进行异源表达时，酶产量较低(约20mg/l)，且酶制剂的比活偏低。这使得链霉菌属来源的透明质酸酶无法满足商业化的需求。因此，从链霉菌属中发掘高活力、底物降解特征和寡糖生成特征明确的工具型透明质酸酶具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术的不足，提供一种链霉菌属来源的透明质酸裂解酶HyaL16-3及其编码基因与应用。本专利技术是通过以下技术方案实现的：一种来源于链霉菌CB16菌株的透明质酸裂解酶HyaL16-3，氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。链霉菌(Streptomycessp.)CB16来源于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期2016年4月11日，保藏编号CGMCCNo.12351。上述透明质酸裂解酶HyaL16-3的编码基因，核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。上述透明质酸裂解酶HyaL16-3的编码基因，全长共2412bp，所编码蛋白质含有804个氨基酸，分子量约为85.5kD。一种重组表达载体，在表达载体中插入了上述透明质酸裂解酶HyaL16-3的编码基因。优选的，所述的表达载体为质粒pET30a(+)或质粒pColdTF。一种重组菌，在宿主细胞中转入了上述重组表达载体。优选的，所述宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)。上述透明质酸裂解酶HyaL16-3的编码基因、重组表达载体、重组菌在制备透明质酸裂解酶HyaL16-3中的应用。上述透明质酸裂解酶HyaL16-3在降解透明质酸多糖(HA)制备不饱和透明质酸二糖中的应用。上述透明质酸裂解酶HyaL16-3在降解A-型硫酸软骨素(CS-A)制备不饱和二糖中的应用。上述透明质酸裂解酶HyaL16-3在降解C-型硫酸软骨素(CS-C)制备不饱和二糖中的应用。有益效果本专利技术所述的透明质酸裂解酶HyaL16-3以透明质酸或硫酸软骨素为底物时，在50℃、pH6.0条件下具有最高酶活力。HyaL16-3对透明质酸的比活为10,306U/mg、对硫酸软骨素A的比活为1,640U/mg、对硫酸软骨素C的比活为1,330U/mg。HyaL16-3可用于专一性制备不饱和透明质酸二糖、不饱和CS-A二糖、不饱和CS-C二糖，应用前景广阔。本专利技术还对重组酶rHyaL16-3的底物降解特征和寡糖生成特征进行了研究，并阐明了寡糖的结构特征，为重组酶rHyaL16-3作为工具酶使用奠定基础。附图说明图1、透明质酸裂解酶HyaL16-3功能模块构成的BLASTp分析结果；图2A、重组质粒pE30-HyaL16-3在E.coliBL21(DE3)菌株中表达的重组透明质酸裂解酶rHyaL16-3及纯化情况的本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种来源于链霉菌CB16菌株的透明质酸裂解酶HyaL16‑3，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
【技术特征摘要】
1.一种来源于链霉菌CB16菌株的透明质酸裂解酶HyaL16-3，氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。2.权利要求1所述透明质酸裂解酶HyaL16-3的编码基因，核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。3.一种重组表达载体，在表达载体中插入了权利要求2所述透明质酸裂解酶HyaL16-3的编码基因。4.如权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于，所述的表达载体为质粒pET30a(+)或质粒pColdTF。5.一种重组菌，在宿主细胞中转入了权利要求3所述重组表达载体。6.如权利要求5所述的重组菌，其特征在于，所述...
【专利技术属性】
技术研发人员：韩文君，刘会会，李俊鸽，古静燕，李福川，李新，卫洁，
申请(专利权)人：济南悟通生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：山东,37
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