分离纯化Salsolinol合成酶的方法技术

分离纯化Salsolinol合成酶的方法，属于蛋白纯化领域。采用高氯酸沉淀法对Salsolinol合成酶的粗酶液进行预处理；将经过高氯酸处理的Salsolinol合成酶的粗酶液中加入K2CO3，于‑80℃放置一段时间如15分钟后取出，离心，取上清液；对所得上清液进行超滤，至少包括采用截留分子量3kD的超滤管，对超滤后的滤液采用亲水色谱(HILIC)的方法进一步分离纯化Sal合成酶。采用本发明专利技术方程能完全纯化Salsolinol合成酶。

Isolation and purification of Salsolinol synthetase

The method of separating and purifying the Salsolinol synthase belongs to the domain of protein purification. The pretreatment of crude enzyme solution using perchloric acid precipitation of Salsolinol synthase; after adding K2CO3 crude enzyme solution perchloric acid treatment of Salsolinol synthetase, to 80 DEG C for a period of time such as 15 minutes, centrifugation, supernatant; of supernatant obtained by ultrafiltration, including at least the mwcos 3kD ultrafiltration device of the filtrate after ultrafiltration by hydrophilic interaction chromatography (HILIC) method for the further purification of Sal synthase. The Salsolinol synthetase can be completely purified by the equation of the invention.

【技术实现步骤摘要】
分离纯化Salsolinol合成酶的方法
本专利技术属于蛋白纯化领域，具体而言，本专利技术涉及分离纯化Salsolinol合成酶的方法。
技术介绍
Sal合成酶(Salsolinolsynthase)是儿茶酚异喹啉类物质合成代谢过程中的首个关键酶，它是一种催化多巴胺(DA)和乙醛(AcH)生成多巴胺能神经毒性物质Salsolinol的酶，直接影响到Sal及其衍生物在体内的代谢过程，是帕金森病的重要内源性致病因子与其致病密切相关。迄今为止，关于Sal合成酶的研究报道甚少，仅有少数研究人员对其性质做了部分研究工作，但其具体性质仍不清楚。目前推测Sal合成酶可能是一种能催化内源性神经毒素生成的新酶，但它尚未获得分离纯化，更无酶活检测、酶学性质方面的系统研究。
技术实现思路
Sal合成酶是一种至今为止尚未获得分离纯化的蛋白质，对其酶学性质知之甚少，研究显示Sal合成酶具有的分子量小、极性较强等特点。基于此，本专利技术建立一套基于酸沉淀法、超滤法和亲水色谱(HILIC)法等技术的专门针对Sal合成酶的分离纯化新方法，它具有操作简便、回收率高等优点。分离纯化Salsolinol合成酶的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)采用高氯酸沉淀法对Salsolinol合成酶的粗酶液进行预处理；(2)将步骤(1)经过高氯酸处理的Salsolinol合成酶的粗酶液中加入K2CO3，于-80℃放置一段时间如15分钟后取出，离心，取上清液；(3)对步骤(2)所得上清液进行超滤，至少包括采用截留分子量3kD的超滤管；进一步还包括在采用截留分子量3kD的超滤管之前，采用截留分子量大于3kD如100kD的超滤管进行超滤；(4)对步骤(3)超滤后的滤液采用亲水色谱(HILIC)的方法进一步分离纯化Sal合成酶；进一步优选进行两次亲水色谱(HILIC)分离纯化方法；主要采用硅胶、氰基或氨基等色谱柱，采用乙腈水溶液作为流动相或洗脱，乙腈的体积百分含量为50-95％，按照乙腈比例从高到低依次洗脱；进一步优选，还包括在采用亲水色谱(HILIC)的方法进一步分离纯化Sal合成酶之后再通过电泳方法进一步分离纯化分子量相对更小的Sal合成酶。电泳方法采用Tris-TricineSDS-PAGE进行分离。进一步优选，步骤(1)采用高氯酸溶液，高氯酸溶液中还含有偏亚硫酸钠和EDTA，进一步优选1M高氯酸、10mM偏亚硫酸钠和10mMEDTA，高氯酸溶液与Salsolinol合成酶的粗酶液的体积比为1:5；进一步优选步骤(2)中K2CO3的摩尔数是步骤(1)中高氯酸的0.5倍；高氯酸(PCA)是一种强酸，为无色透明液体的无水酸，可以使大部分蛋白沉淀；本专利技术粗酶液加入高氯酸经过高氯酸的作用后，其中的Sal合成酶就不能催化底物DA和AcH生成Sal，但加入K2CO3使生成高氯酸钾沉淀以除去体系中的高氯酸，并且使酸性环境得以中和后Sal合成酶活性几乎完全恢复。说明，PCA沉淀除去绝大部分蛋白后，Sal合成酶仍然存在于上清液中，即该酶不会被PCA除去，具有较强的耐酸性。通过酸沉淀后，酶液中的杂蛋白已经很少，本专利技术进一步通过超滤法对酶液中的蛋白按照分子量大小不同进行分离，由于酸沉淀将绝大部分大分子蛋白除去，本专利技术在超滤过程中主要选择两种截留分子量规格的超滤管，即100kD和3kD，通过超滤，分别得到三部分不同截留分子量的组分：分子量大于100kD的组分(P1)、分子量在3kD和100kD之间的组分(P2)和分子量小于3kD的组分(P3)。检测三个组分的Sal合成酶活性，结果如图1所示。与粗酶液活性的比较结果显示，Sal合成酶的活性主要存在于第三个组分(P3)中。由于超滤膜有3倍效应，即一些截留分子量大于所使用超滤膜3倍的分子也能通过超滤膜离心的下层滤过液中，故可以得知Sal合成酶分子量在9kD以下。由于Sal合成酶具有强极性，本专利技术选择亲水色谱(HILIC)的方法进一步分离纯化Sal合成酶。首先采用HILIC制备柱进行大量的制备，按照乙腈比例从高到低依次洗脱，如图2所示，Sal合成酶活性主要存在于50-52min，该馏分所对应的乙腈比例为55.5-61％。从紫外吸收峰上可以看出在50-52min之内，含有一定的蛋白或多肽成分，需要进一步分离纯化。通过HILIC制备柱分离纯化后所得的50-52min馏分，再在HILIC分析柱上进一步进行分离。洗脱梯度同HILIC制备柱的洗脱梯度，如图3结果显示，Sal合成酶活性主要存在于38-39min馏分，此时所对应的紫外吸收峰中所含有的蛋白或肽的量非常少。经过超滤后，P3组分中所含蛋白的分子量较低，因此本专利技术方法选择能分离低分子量蛋白的电泳方法即Tris-TricineSDS-PAGE，该方法通过银染能检测到分子量低于1kD的蛋白或多肽分子，灵敏度较高。图4即为超滤P3组分和HILIC制备柱分离的50-52min馏分的电泳银染结果，呈现单一条带，说明经上述纯化步骤，Sal合成酶达到电泳纯。最后对蛋白胶进行电洗脱法进行回收，得到纯化后的Sal合成酶。附图说明图1是超滤后不同组分的Sal合成酶活性的比较。其中Control：酸沉淀并中和后的上清；P1：COMW>100kD；P2：3kD<COMW<100kD；P3：COMW<3kD图2是HILIC制备柱分离P3组分所得的色谱图及酶活检测结果。不同类型的曲线的含义：(…)表示乙腈洗脱梯度，(—)表示214nm的吸收峰，(—◆)表示各馏分的Sal合成酶活性。图3是HILIC分析柱分离50-52min馏分所得的色谱图及酶活检测结果。不同类型的曲线的含义：(…)表示乙腈洗脱梯度，(—)表示214nm的吸收峰，(—◆)表示各馏分的Sal合成酶活性。图4是Tris-TricineSDS-PAGE电泳结果。泳道1为超滤的P3组分，泳道2为HILIC制备柱的50-52min组分；具体实施方式下面结合实施例对本专利技术做进一步说明，但本专利技术并不限于以下实施例。实施例1一、酸沉淀1.1配制1M高氯酸(PCA)溶液(1M高氯酸、10mM偏亚硫酸钠和10mMEDTA)和2M的碳酸钾溶液；1.2将粗酶液按照体积比5:1与1MPCA混合，混匀后，以17,000g/min，4℃离心10min，取上清；1.3中和：上清液中加入一定比例的K2CO3溶液(高氯酸的摩尔量是K2CO3的2倍)，于-80℃放置15min后取出，17,000g/min，4℃离心10min，取上清，通过该步骤除去溶液中的高氯酸。二、超滤超滤法是以压力差为推动力，通过膜表面的微孔结构对目标物质进行选择性分离，是一种膜分离技术。在一定外力作用下，原液流过透析膜表面时是以一定的流速沿着膜表面流动，溶液中的溶剂及低分子量物质则会透过膜表面的微孔，成为透过液，而原液中高分子量物质或颗粒性物质则被膜截留，溶液被浓缩成为浓缩液，从而使原液得到分离、浓缩的目的。目前常用的超滤膜主要有醋酸纤维膜和聚砜膜等，而超滤的膜组件也有不同类型，如板式、管式、卷式等。本专利技术主要采用两种Millopore的超滤管，其截留分子量分别为100kD和3kD，体积为15mL。2.1将酸沉淀后的样品作为原液加入100kD超滤管装置中，8,000g/min，4℃离心20m本文档来自技高网...

【技术保护点】
分离纯化Salsolinol合成酶的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)采用高氯酸沉淀法对Salsolinol合成酶的粗酶液进行预处理；(2)将步骤(1)经过高氯酸处理的Salsolinol合成酶的粗酶液中加入K2CO3，于‑80℃放置一段时间如15分钟后取出，离心，取上清液；(3)对步骤(2)所得上清液进行超滤，至少包括采用截留分子量3kD的超滤管；(4)对步骤(3)超滤后的滤液采用亲水色谱(HILIC)的方法进一步分离纯化Sal合成酶。

【技术特征摘要】
1.分离纯化Salsolinol合成酶的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)采用高氯酸沉淀法对Salsolinol合成酶的粗酶液进行预处理；(2)将步骤(1)经过高氯酸处理的Salsolinol合成酶的粗酶液中加入K2CO3，于-80℃放置一段时间如15分钟后取出，离心，取上清液；(3)对步骤(2)所得上清液进行超滤，至少包括采用截留分子量3kD的超滤管；(4)对步骤(3)超滤后的滤液采用亲水色谱(HILIC)的方法进一步分离纯化Sal合成酶。2.按照权利要求1所述的分离纯化Salsolinol合成酶的方法，其特征在于，主要采用硅胶、氰基或氨基色谱柱，采用乙腈水溶液作为流动相或洗脱，乙腈的体积百分含量为50-95％，按照乙腈比例从高到低依次洗脱。3.按照权利要求1所述的分离纯化Salsolinol合成酶的方法，其特征在于，进行两次亲水色谱(HILIC)分离纯化方法。4.按照权利要求1所述的分离纯化Salsolinol合成酶的方法，其特征在于...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈薛钗，邓玉林，
申请(专利权)人：北京工业大学，北京理工大学，
类型：发明
国别省市：北京,11