一种褐藻胶裂解酶及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种褐藻胶裂解酶及其应用。本发明专利技术还公开利用基因工程的技术方法，将该新褐藻胶裂解酶的基因克隆到大肠杆菌表达载体上，获得可异源表达该酶的大肠杆菌重组菌株，用该菌株异源表达来制备的褐藻胶裂解酶AlgNJ‑04，具有降解褐藻酸钠制备褐藻酸钠寡糖的功能。本发明专利技术提供的褐藻胶裂解酶AlgL可广泛应用于化工、农业、食品、饲料添加、医药及海藻遗传工程等领域。

A alginate lyase and its application

The present invention discloses a alginate lyase and its application. The invention also discloses a method using the technology of genetic engineering, the alginate lyase gene was cloned into Escherichia coli expression vector, obtain the heterologous expression of recombinant Escherichia coli strains of the enzyme, with the strain of heterologous expression for alginate lyase AlgNJ by 04, with degradation of sodium alginate preparation the function of sodium alginate oligosaccharides. The alginate lyase AlgL provided by the invention can be widely used in the fields of chemical industry, agriculture, food, feed additive, medicine and seaweed genetic engineering, etc..

【技术实现步骤摘要】
一种褐藻胶裂解酶及其应用
本专利技术属于基因工程
，具体涉及一株褐藻胶裂解酶基因及其应用。
技术介绍
我国拥有广阔的海域面积，其中蕴含着丰富的海洋生物资源，尤其是海藻资源。褐藻主要包括海带、裙带等，其细胞壁中富含的褐藻胶是一种直链酸性多糖，在天然状态下，褐藻胶的主要存在状态为水溶性的褐藻酸钠(sodiumalginate)、褐藻酸钾等褐藻酸盐类和水不溶性的褐藻酸(alginicacid)。目前市场上的褐藻酸钠(商品名为海藻酸钠)或其他褐藻酸盐主要是从褐藻中获得。研究发现降解褐藻酸钠所得到的寡糖具有多种生物活性，比如免疫调节、促生长、诱导植物抗性和提高蛋白质稳定性等，因而可广泛应用于化工、农业、食品、饲料添加和医药等领域(刘航,天然产物研究与开发,2012,24:201-204)。褐藻酸钠可用多种方法降解，包括化学降解法、物理降解法和酶降解法。化学降解法以酸降解为主，但该方法降解条件难以控制，操作较复杂，耗时长。物理降解法包括辐射法和超声法等，一般与其他降解法一起使用，降解产物的极限分子质量为50kDa左右，不易制得寡糖。而用褐藻胶裂解酶降解褐藻酸钠具有降解条件温和，得率高等优点，且因为酶的底物专一性，能为后续研究寡糖化学结构提供信息，故而褐藻胶裂解酶逐步成为优先降解褐藻酸钠的方法。另外，褐藻胶裂解酶还能应用于肺囊肿性纤维化症的治疗、海藻饲料加工及海藻遗传工程等领域的研究(WongTYetal.AnnualReviewofMicrobiology,2000,54:289-340)。褐藻酸裂解酶来源于海洋动植物和多种微生物(包括海洋细菌、土壤细菌和真菌)。褐藻酸钠裂解酶按其底物专一性可分为两大类：1,4-D-甘露糖醛酸片段裂解酶(EC4.2.2.3)和1,4-L-古罗糖醛酸片段裂解酶(EC4.2.2.11)。至今，褐藻胶裂解酶的生产大多依赖原始产酶动植物或微生物来获得酶蛋白，此种方法虽然能有效的获得一定量的酶蛋白，但产量有限，成本较高，较难满足实际应用需求。随着生物技术的发展，提供了利用基因工程高效生产褐藻胶裂解酶的技术方法。DongEunKim等根据已知的相关功能基因的相似序列设计PCR引物，从Streptomycessp.ALG-5菌株中克隆到了一个褐藻胶裂解酶基因，并在EscherichiacoliBL21(DE3)中成功表达(Kimetal.MarineBiotechnology.2009.11:10-16)。采用这一策略必须对相关基因序列有一定的了解才能设计PCR引物，并且找到的是某一类结构或功能相似蛋白质中的新分子，较难发现全新的基因。随着高通量测序技术的不断发展，越来越多的产褐藻胶裂解酶的微生物基因组序列得以测定，这使得通过基因组挖掘技术来分析序列信息，对编码褐藻胶裂解酶的基因进行钓取变得简洁快速，BadurAH等对来源于海洋的一株细菌Vibriosplendidus的基因组进行序列测定，通过分析发现该菌株中含有4个编码褐藻胶裂解酶的基因，对其进行了基因克隆和在大肠杆菌EscherichiacoliBL21(DE3)中的重组表达(BaduretalAppl.Environ.Microbiol.2015.81：1865-1873)；目前获得褐藻胶裂解酶大多数是专一性降解均聚甘露糖醛酸的褐藻胶裂解酶，少数是具有具有降解古洛糖醛酸活性的褐藻胶裂解酶，而具有广泛底物特异性的褐藻胶裂解酶则非常稀少，只有来源于Pseudoalteromonassp.的褐藻胶裂解酶Aly-SJ02(李建伟,MarineDrugs,2011,21:1374-80)，来源于白蚁肠道的Isoptericolahalotolerans的褐藻胶裂解酶AlyIH(窦文芳等,CarbohydratePolymers,2013,98:1476-82)等具有广泛底物特异性的酶活力较低，而且稳定性差，其中AlyIH只是获得了纯化的酶，尚未获得其编码基因，不能进行重组表达和分子改造；而且大多数褐藻胶裂解酶活性较低。本专利技术涉及的重组褐藻胶裂解酶具有高活性和高稳定性的特点，其降解产物为低聚合度(主要是二糖、三糖和四糖)的褐藻胶寡糖，具有重大的工业化应用前景。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是，提供一种新型褐藻胶裂解酶。本专利技术还要解决的技术问题是，提供包含上述褐藻胶裂解酶的基因工程菌及其构建方法。本专利技术最后要解决的技术问题是，提供上述褐藻胶裂解酶的应用。为解决上述技术问题，本专利技术采用如下技术方案：一种褐藻胶裂解酶基因，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。一种褐藻胶裂解酶，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。包含上述褐藻胶裂解酶的基因工程菌，该菌株中导入了褐藻胶裂解酶基因，所述的褐藻胶裂解酶基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。上述产褐藻胶裂解酶的基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)将褐藻胶裂解酶基因克隆到质粒中，得到重组载体；(2)将重组载体转化宿主菌，得到产褐藻胶裂解酶的基因工程菌。步骤(1)中，所述的质粒为pET21a(+)。步骤(2)中，所述的宿主菌为大肠杆菌DH5α。上述褐藻胶裂解酶在裂解褐藻酸盐和褐藻多糖中的应用在本专利技术的保护范围之内。上述褐藻胶裂解酶的基因工程菌在发酵产褐藻胶裂解酶中的应用在本专利技术的保护范围之内。有益效果：本专利技术的AlgL来源于海洋细菌Vibriosp.NJ-04，通过设计同源引物，获得编码褐藻胶裂解酶AlgL的DNA序列，该基因编码区长1359bp，编码452个氨基酸，其中1-21个氨基酸为信号肽，理论分子量为50.19kDa，属于多糖裂解酶7家族。大肠杆菌重组表达获得的AlgL，对于褐藻胶、polyM和polyG均具有较高活性，属于双功能褐藻胶裂解酶。本专利技术的内切型褐藻胶裂解酶可广泛用于化工、农业、食品和饲料添加、医药及海藻遗传工程等领域。附图说明图1：褐藻胶裂解酶AlgL的蛋白质三维结构模型。图2：重组褐藻胶裂解酶AlgL表达纯化的聚丙烯酰氨凝胶电泳图(SDS-PAGE)。图3:温度、pH对于褐藻胶裂解酶AlgL的活性及稳定性影响曲线。图4：褐藻胶裂解酶降解褐藻胶、polyM和polyG所得产物的电喷雾质谱(ESI-MS)分析图。具体实施方式根据下述实施例，可以更好地理解本专利技术。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本专利技术，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本专利技术。实施例1：菌株Vibriosp.NJ-04的培养及鉴定所采用的菌株来源于采集自黄海海域的海藻样品，经分离得到一株产褐藻胶裂解酶的菌株NJ-04，使用的选择性培养基的配方为：牛肉膏5g、葡萄糖15g、酵母浸粉1.0g、NaCl5.0g、MgSO4·7H2O0.5g、CaCl20.2g、KH2PO41.0g、FeSO4·7H2O0.02g，pH值为7.0。固体培养基添加1.5％的琼脂。将菌落接入100mL液体培养基中进行富集培养，30℃，150rpm培养36h。将获得的菌液进行系列稀释后涂布到固体选择培养上取4mL已经培养好的菌液，置于2mLtube管中，5000g，10min充分离心。弃去上清，用180μL消化液(DigestionSolution)将菌体重悬，再加入20μL蛋白酶K本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种褐藻胶裂解酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种褐藻胶裂解酶基因，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。2.一种褐藻胶裂解酶，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。3.包含上述褐藻胶裂解酶的基因工程菌，其特征在于，该菌株中导入了褐藻胶裂解酶基因，所述的褐藻胶裂解酶基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。4.权利要求3所述的产褐藻胶裂解酶的基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)将褐藻胶裂解酶基因克隆到质粒中，得到重组载体；(2)将重组载体...

【专利技术属性】
技术研发人员：王学江，李峰，张志凯，迟艳，
申请(专利权)人：五洲丰农业科技有限公司，
类型：发明
国别省市：山东,37