用于纯化硫酸软骨素酶ABC的方法技术

本发明专利技术公开了用于纯化硫酸软骨素酶ABC的方法。该方法包括使用固定有肝素的亲和柱，通过层析法从所述含有硫酸软骨素酶ABC的基质中获得纯化的所述硫酸软骨素酶ABC。该方法能够获得高纯度的硫酸软骨素酶ABC，并且具有简单和高回收率的优点。

Process for the purification of chondroitin sulfate ABC

The present invention discloses a method for purifying chondroitin sulfate ABC. The method includes obtaining an purified chondroitin sulfate enzyme ABC from the matrix containing chondroitin sulfate ABC by using an affinity column immobilized with heparin. The method is capable of obtaining high purity chondroitin sulfate ABC, and has the advantages of simplicity and high recovery.

【技术实现步骤摘要】
用于纯化硫酸软骨素酶ABC的方法
本专利技术涉及用于纯化硫酸软骨素酶ABC(ChABC)的方法，尤其涉及从含有ChABC的基质纯化ChABC的方法。
技术介绍
硫酸软骨素是生物系统中最丰富的糖胺聚糖，由包括硫酸化葡萄糖醛酸、N-乙酰半乳糖胺、艾杜糖醛酸等的多种硫酸化和非硫酸化碳水化合物衍生物组成。该聚合物通常与蛋白质连接，形成硫酸软骨素蛋白多糖(CSPG)，在生物系统中发挥许多结构和功能作用(例如，使细胞-细胞相互作用的细胞外基质、指导或抑制神经发育、合成软骨以及成为结构成分)。这些分子的生物合成并保持合适的位置对于人的正常功能是至关重要的。事实上，许多疾病与CSPG的缺乏、积累和脱位有关，如弥漫性路易体病、粘多糖病Ⅳ-A型和粘多糖病Ⅶ型、椎间盘突出症等。硫酸软骨素酶是可以有效降解硫酸软骨素的细菌酶。这组酶可以分为具有不同活性和底物特异性的4种类型(硫酸软骨素酶ABC，软骨素酶AC，硫酸软骨素酶B和硫酸软骨素酶C)。最近已证明这些酶，特别是硫酸软骨素酶ABC是用于治疗许多CSPG相关疾病的潜在的新生物药物，例如，McMachon和同事已经发现ChABC可以显著促进受损的脊髓的功能恢复。Kubota和Naitoh也证明将硫酸软骨素酶注射到瘢痕疙瘩和/或肥厚性瘢痕患者的受影响部分可以大大改善症状。Takahashi还开发了使用ChABC治疗兔子椎间盘突出症的成功模型。近年的科学研究指出，ChABC还有更多有待开发的医学应用，包括治疗弱视、神经和脊髓损伤，后玻璃体脱离和抑制肿瘤转移。ChABC能否成功作为生物治疗剂应用，明显取决于生产和纯化高纯度ChABC的工艺。ChABC的现有上游生产技术均是基于未修饰的普通变形杆菌(ProteusVulgaris)或重组表达宿主(如大肠杆菌)的发酵。通过适当优化，这两种表达方法都可以产生大量未经纯化含有ChABC的菌液或粗酶液。因为菌液或粗酶液含有大量蛋白质、核酸及内毒素等杂质，开发高效的下游纯化方法对于获得高纯度ChABC至为关键。此外，来自不同表达宿主的杂质的份量和性质非常不同，所以为了纯化来自特定表达宿主的ChABC将需要单独制定的特定的下游纯化程序，特别是当只使用非特异性相互作用的离子交换(IEX)或疏水相互作用(HIC)层析时更是如此。事实上，IEX/HIC层析法的开发和优化非常耗时，需要投入大量人力物力，而通常的结果是需要多个IEX/HIC层析步骤以获得高纯度的目标蛋白，代价是大幅降低回收率及长时间的纯化流程。相对于IEX/HIC层析法，在蛋白质纯化中应用亲和层析法具有显著的优点，例如相对快速的优化过程，简单的层析过程，高洗脱液纯度，高回收率等。在亲和层析法中，与靶蛋白的特异性相互作用的分子或分子部分固定在填料上。这种高度选择性相互作用能有效地提取需要的蛋白及去除杂质。此外，利用亲和层析作为ChABC的纯化工具从未被探索过，因此开发新的且有效的亲和层析方法对于生产作为生物治疗药物的ChABC将具有莫大贡献。然而，设计ChABC的亲和层析是不容易的。这是因为可以特异性结合ChABC的大多数已知分子是ChABC的底物，其在与酶结合时将被降解。换句话说，如果这些底物分子固定在固定相上，那么它们在纯化过程中将被酶分解，从而不能从溶液中捕获ChABC。硫酸软骨素酶ABC具有比硫酸软骨素酶AC、硫酸软骨素酶B和硫酸软骨素酶C具有更广的底物谱。这使得设计ChABC的亲和层析相比于硫酸软骨素酶AC、硫酸软骨素酶B和硫酸软骨素酶C更加困难。在Yosizawa等人的研究(1979)中，公开了一种纯化硫酸软骨素酶B及硫酸软骨素酶C的方法，包括使用羟基磷灰石柱从肝素黄杆菌的粗酶提取物中分离粗硫酸软骨素酶C级分和粗硫酸软骨素酶B级分；然后使用磷酸纤维素柱进一步纯化粗硫酸软骨素酶C级分和粗硫酸软骨素酶B级分，最后用硫酸皮肤素包被的结合硫酸皮肤素的AH-Sepharose4B柱使硫酸软骨素酶C与透明质酸酶分离，用硫酸皮肤素包被的结合肝素的AH-Sepharose4B柱使硫酸软骨素酶B与Δ4,5葡萄糖醛酸酶(glycosiduronase)和硫酸酯酶分离。Yosizawa的研究强调采用同一种或另一种糖胺聚糖非共价包被糖胺聚糖结合(共价)的AH-Sepharose4B对于硫酸软骨素酶的分离纯化是非常重要的。因此，具有简单、高回收率优点的利用亲和层析纯化ChABC的技术仍是本领域所需的。
技术实现思路
为解决现有技术中存在的问题，专利技术人发现，肝素不仅能够特异性结合ChABC，而且在结合时不会被降解。基于该意想不到的发现，本专利技术提供了一种从含有ChABC的基质纯化ChABC的方法，包括使用固定有肝素的亲和柱，通过层析法从含有ChABC的基质中获得高度纯化的ChABC。根据本专利技术的一个方面，所述方法包括将含有硫酸软骨素酶ABC的基质加载到结合有肝素的亲和柱上。根据本专利技术的一个方面，本专利技术的从含有ChABC的基质纯化ChABC的方法包括如下步骤：用预平衡缓冲液预平衡亲和柱；将样品溶液加载到预平衡后的亲和柱上；用洗涤液洗涤加载后的亲和柱以去除非特异性结合的蛋白质；以及用洗脱液洗脱所述硫酸软骨素酶ABC；其中，所述洗涤液为pH8-10的缓冲液，所述洗脱液为pH6-9NaCl线性梯度溶液。根据本专利技术的另一个方面，本专利技术的从含有ChABC的基质纯化ChABC的方法还包括在所述洗脱步骤之后通过过滤去除含有ChABC的洗脱液中的内毒素。根据本专利技术的又一个方面，本专利技术的从含有ChABC的基质纯化ChABC的方法还包括将所述含有硫酸软骨素酶ABC的基质的pH值调节至7.0，和/或将导电率调节到1-5mS/cm范围内。在一个实施方式中，本专利技术的从含有ChABC的基质纯化ChABC的方法还包括将导电率调节到1.2、1.6、2、3、4、4.5或4.8mS/cm。根据本专利技术的又一个方面，所述洗涤液为碳酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液或Tris乙酸盐缓冲液。根据本专利技术的又一个方面，所述基质包括细菌、真菌、昆虫或动物的细胞匀浆、含有表面活性剂的提取物和/或在发酵过程中收集的上清液。根据本专利技术的又一个方面，所述基质包括来自大肠杆菌(Escherichiacoli)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、普通变形杆菌(Proteusvulgaris)、巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)、和酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的一种或多种的匀浆或提取物。根据本专利技术的又一个方面，所述肝素固定在具有羟基、氨基和/或羧基的用于蛋白质纯化的树脂上。进一步地，所述肝素利用共价键结合到所述树脂上。根据本专利技术的又一个方面，固定有肝素的亲和柱不进一步使用糖胺聚糖包被。根据本专利技术的又一个方面，所述树脂包括琼脂糖、纤维素、葡聚糖、二氧化硅聚丙烯酰胺和丙烯酸聚合物的一种或多种。根据本专利技术的又一个方面，所述预平衡缓冲液为pH7.0-7.5缓冲液。本专利技术的从含有ChABC的基质纯化ChABC的方法能够获得高纯度的硫酸软骨素酶ABC，并且具有简单和高回收率的优点。附图说明图1示出本专利技术实施例2的层析图。图2示出本专利技术实施例3的层析图。图3示出本专利技术实施例3的SDS-PAGE图；其本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种从含有硫酸软骨素酶ABC的基质纯化硫酸软骨素酶ABC的方法，包括使用固定有肝素的亲和柱，通过层析法从所述含有硫酸软骨素酶ABC的基质中获得纯化的所述硫酸软骨素酶ABC。

【技术特征摘要】
1.一种从含有硫酸软骨素酶ABC的基质纯化硫酸软骨素酶ABC的方法，包括使用固定有肝素的亲和柱，通过层析法从所述含有硫酸软骨素酶ABC的基质中获得纯化的所述硫酸软骨素酶ABC。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括将含有硫酸软骨素酶ABC的基质加载到结合有肝素的亲和柱上。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：用预平衡缓冲液预平衡所述亲和柱；将样品溶液加载到预平衡后的亲和柱上；用洗涤液洗涤加载后的亲和柱以去除非特异性结合的蛋白质；以及用洗脱液洗脱所述硫酸软骨素酶ABC；其中，所述洗涤液为pH8-10缓冲液，所述洗脱液为pH6-9NaCl线性梯度溶液。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，纯化后硫酸软骨素酶ABC的内毒素水平低于0.0002EU/U。5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述方法还包括在所述洗脱步骤之后通过过滤去除含有所述硫酸软骨素酶ABC的洗脱液中的内毒素的步骤。6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述洗涤液为碳酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液或Tris乙酸盐缓冲液。7.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述方法还包括将所述含有硫酸软骨素酶ABC的基质...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄炳镠，钟玮康，
申请(专利权)人：爱华生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：中国香港,81