一种ZmEDS基因及其编码蛋白、定点突变基因及应用制造技术

本发明专利技术公开了一种ZmEDS基因及其编码蛋白，该基因的核苷酸序列和氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。本发明专利技术还公开了一种ZmEDS基因的定点突变基因ZmEDS‑F303A、ZmEDS‑G411C、ZmEDS‑V306A和ZmEDS‑I279G。本发明专利技术还公开了一种ZmEDS基因及其定点突变基因ZmEDS‑F303A、ZmEDS‑G411C、ZmEDS‑V306A和ZmEDS‑I279G的编码蛋白在倍半萜生物合成上的应用。ZmEDS及其定点突变基因所编码的蛋白在倍半萜类化合物的生产中可用于产生多种新的倍半萜类化合物，对倍半萜的生产及运用具有重要理论及实践意义。

ZmEDS gene and its coding protein, site directed mutant gene and application thereof

The invention discloses a ZmEDS gene and its encoding protein, nucleotide sequence and amino acid sequence of the gene were ID such as SEQ NO:1 and SEQ ID shown in NO:2. The invention also discloses a point mutation of ZmEDS gene and ZmEDS F303A gene ZmEDS G411C, ZmEDS V306A and ZmEDS I279G. The present invention also discloses the application of a ZmEDS gene and ZmEDS gene mutation F303A, ZmEDS G411C, ZmEDS V306A and ZmEDS I279G encoding protein in sesquiterpene biosynthesis. ZmEDS and its mutant gene encoding protein can be used to produce sesquiterpene compounds in a variety of new sesquiterpene compounds in the production of production, and has important theoretical and practical significance of sesquiterpenes.

【技术实现步骤摘要】
一种ZmEDS基因及其编码蛋白、定点突变基因及应用
本专利技术属于农作物基因工程领域，具体地说，涉及一种ZmEDS基因及其编码蛋白、定点突变基因及应用。
技术介绍
萜类化合物是自然界中数量最多、种类最广的一大类天然产物。根据其化学组成，可将萜类分为半萜(C5)、单萜(C10)、倍半萜(C15)、二萜(C20)等。其中倍半萜类具有多种生理生化作用，如广泛的药用价值、抗虫抗菌活性、化感作用等。例如从黄花蒿中分离得到的倍半萜内酯青蒿素是治疗疟疾的有效成分。而玉米倍半萜合酶ZmTPS6/11则可催化倍半萜类底物法尼基焦磷酸(farnesyldiphosphate，FPP)生成β-marcocarpene(T.G.Kollner，C.Schnee，S.Li，etal.Protonationofaneutral(S)-beta-bisaboleneintermediateisinvolvedin(S)-beta-macrocarpeneformationbythemaizesesquiterpenesynthasesTPS6andTPS11[J].JournalofBiologicalChemistry.2008，283；20779-20788.)，在细胞色素P450氧化酶基因CYP71Z18的催化下形成玉米植保素zealexinA1，以参与玉米对抗病原真菌的侵染的防御反应(MaoH，JiangL，FeiR，etal.CharacterizationofCYP71Z18indicatesaroleinmaizezealexinbiosynthesis[J].Phytochemistry，2015，121：4-10.)。倍半萜类生物合成是在萜类前体物质合成的基础上，通过异戊二烯基转移酶(PrenylTransferases，PTS)的作用产生15个碳原子的FPP，FPP在不同的倍半萜合酶(sesquiterpenesynthases)的催化下生成相应的倍半萜类化合物。目前见报道的多种具有重要生物活性的萜类往往具有多个氧化基团，但以往的研究表明萜类合酶只能催化产生具有全碳氢骨架的萜烯或只含一个氧原子的萜类一元醇(ThollD.Biosynthesisandbiologicalfunctionsofterpenoidsinplants[J].AdvancesinBiochemicalEngineering/biotechnology，2015，148：63.)，萜类骨架需被下游的其他氧化酶进一步氧化修饰才能产生相应的活性产物。因此，探究植物中倍半萜合酶的生理功能，对于植物生产中生物胁迫和非生物胁迫具有重要的指导及应用价值。另外，若可以利用萜类合酶直接催化底物生成更为丰富多样的萜类骨架，对于下游的具有生物活性的萜类化合物的生产及应用具有重要意义。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术针对上述的问题，提供了一种ZmEDS基因及其编码蛋白、定点突变基因及应用，本专利技术通过大肠杆菌代谢工程，发现ZmEDS能够催化(E，E)-FPP产生含两个羟基的倍半萜二元醇eudesmane-2α，11-diol。本专利技术通过对ZmEDS进行定点突变、微生物代谢工程、产物分离纯化、核磁共振检测等技术，分离得到了eudesmane-2α，11-diol、3-epi-cryptomeridiol、2，3-epi-cryptomeridiol等三种倍半萜二元醇和valerianol、(+)-hedycaryol、2-epi-α-eudesmol、eremophil-6-en-11-ol等四种倍半萜一元醇。本专利技术证实通过对关键氨基酸残基定点突变可以改变ZmEDS的催化产物，为倍半萜类化合物的生产及改造萜类合酶来产生新的萜类化合物提供理论依据。为了解决上述技术问题，本专利技术公开了一种ZmEDS基因，该基因的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示，该基因是玉米中与倍半萜类化合物合成代谢有关的基因。该基因的DNA序列由1674个碱基组成。本专利技术还公开了一种ZmEDS基因编码的蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO：2所示。该编码蛋白由557个氨基酸残基组成。本专利技术通过对ZmEDS基因进行定点突变分别得到了4个编码ZmEDS的单氨基酸突变蛋白，分别为ZmEDS-F303A、ZmEDS-G411C、ZmEDS-V306A和ZmEDS-I279G，上述4个经定点突变得到的基因所编码的氨基酸序列如SEQIDNO：3～6所示。本专利技术中含有ZmEDS基因的原核表达载体、细胞系及宿主菌和使用pET28/ZmEDS进行定点突变得到的4个原核表达载体、细胞系及宿主菌在本专利技术的保护范围之内。本专利技术中分别含有ZmEDS、ZmEDS-F303A、ZmEDS-G411C、ZmEDS-V306A、ZmEDS-I279G质粒和pMEVT-MBIS质粒的大肠杆菌BL21菌种也在本专利技术的保护范围之内。本专利技术还提供了利用硅胶柱层析、气相色谱-质谱联用(GC-MS)、薄层色谱法(TLC)、核磁共振法(NMR)检测等技术，对ZmEDS及四个定点突变蛋白原核表达的三种倍半萜二元醇和四种倍半萜一元醇产物进行分离纯化的方法，此分离方法也在本专利技术的保护范围之内。本专利技术还公开了一种ZmEDS基因及其定点突变基因ZmEDS-F303A、ZmEDS-G417C、ZmEDS-V306A和ZmEDS-I279G的编码蛋白在调节和生产植物二萜类化合物中的应用。进一步地，该应用包括以下步骤：1)将SEQIDNO：1基因克隆到原核表达载体pET-28a(+)中，插入限制性内切酶NdeI和EcoRI位点间，得到重组质粒pET28a/ZmEDS；2)对ZmEDS的303位、411位、306位和第279位四个氨基酸位点进行定点突变，制备得到含ZmEDS-F303A、ZmEDS-G417C、ZmEDS-V306A、ZmEDS-I279G四个定点突变基因的原核表达质粒；分别是在ZmEDS蛋白序列上的第303位苯丙氨酸突变为丙氨酸、第411位甘氨酸突变为半胱氨酸、第306位缬氨酸突变为丙氨酸和第279位异亮氨酸突变为甘氨酸，并且其余核苷酸序列与ZmEDS的核苷酸序列无异，其蛋白序列分别如SEQIDNO：3-6所示；3)pMEVT/MBIS载体中含有甲羟戊酸(MVA)途径中生成倍半萜前体FPP的一系列基因，包括来自大肠杆菌的乙酰乙酰辅酶A硫解酶基因(atoB)、异戊二烯焦磷酸异构酶基因(idi)、FPP合酶基因(ispA)和来自酿酒酵母的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合酶基因(HMG-CoA)、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因(MVD1)、磷酸甲羟戊酸激酶基因(ERG8)、甲羟戊酸激酶基因(ERG12)、经N端修饰的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因(tHMGR)，为原核表达的体系中提供充足的FPP前体。(MartinVJJ，PiteraDJ，WithersST，etal.EngineeringamevalonatepathwayinEscherichiacoliforproductionofterpenoids.NatureBiotechnology.2003，21(7)：796-802)。将pMEVT/MBIS分别与pET28a/ZmEDS、Z本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种ZmEDS基因，其特征在于，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

【技术特征摘要】
1.一种ZmEDS基因，其特征在于，该基因的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。2.权利要求1所述的ZmEDS基因的编码蛋白，其特征在于，该编码蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。3.权利要求2所述的ZmEDS基因的定点突变基因ZmEDS-F303A、ZmEDS-G411C、ZmEDS-V306A和ZmEDS-I279G，其特征在于，其编码蛋白的氨基酸序列分别如SEQIDNO:3-6所示。4.权利要求2所述的ZmEDS基因及其定点突变基因ZmEDS-F303A、ZmEDS-G411C、ZmEDS-V306A和ZmEDS-I279G的编码蛋白在倍半萜生物合成上的应用。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：1)将SEQIDNO:1基因克隆到原核表达载体pET-28a(+)中，插入限制性内切酶NdeI和EcoRI位点间，得到重组质粒pET28a/ZmEDS；2)对ZmEDS的第303位、411位、306位和279位四个氨基酸位点进行定点突变，分别制备得到含ZmEDS-F303A、ZmEDS-G411C、ZmEDS-V306A、ZmEDS-I279G四个定点突变基因的原核表达质粒；分别是在ZmEDS蛋白序列上的第303位苯丙氨酸突变为丙氨酸、第411位甘氨酸突变为半胱氨酸、第306位缬氨酸突变为丙氨酸和第279位异亮氨酸突变为甘氨酸，并且其余核苷酸序列与ZmEDS的核苷酸序列无异，其蛋白序列分别如SEQIDNO:3-6所示；3)将pMEVT/MBIS分别与pET28a/ZmEDS、ZmEDS-F303A、ZmEDS-G411C、ZmEDS-V306A、ZmEDS-I279G同时加入25μL大肠杆菌BL21感受态细胞中，其中，重组质粒各100-150ng，冰浴20min，42℃热激1min20s，冰上冷却2min后加入液体LB培养基200μL，37℃200rpm下复苏1.5h，再涂布于含有氯霉素50mg/L和硫酸卡那霉素50mg/L的固体LB培养基平板上；37℃倒置过夜培养，第二天划线取平均菌落，置于同时含有氯霉素50mg/L和硫酸卡那霉素50mg/L的5mL液体LB培养基中，37℃200rpm过夜培养；制备得到上述五种菌种，菌种为大肠杆菌BL21背景株系，且每个菌种分别含有两种质粒：①pMEVT/MBIS，pET28a/ZmEDS；②pMEVT/MBIS，ZmEDS-F303A；③pMEVT/MBIS，ZmEDS-G411C；④pMEVT/MBIS，ZmEDS-V306A；⑤pMEVT/MBIS，ZmEDS-I279G；次日取2mL上述菌种置于50mLNZY液体培养基，培养基中加入相应的抗生素，37℃200rpm培养，菌液培养至A600达到0.8-1.0，向其中加入1M的IPTG终浓度至1mM，然后将菌液转至16℃，200rpm诱导培养24h；之后用等体积的正己烷萃取萜类产物，16℃200rpm萃取30min；振荡充分后，取出静置，取上层有机相使用旋转蒸发仪浓缩至1mL，转移至GC样品瓶中，制备得到倍半萜类化合物，用于GC-MS检测。6...

【专利技术属性】
技术研发人员：王强，梁瑾，谌琴琴，
申请(专利权)人：四川农业大学，
类型：发明
国别省市：四川,51