一种改造腈水合酶及其应用制造技术

本发明专利技术公开了属于酶工程和工业微生物技术领域的一种改造腈水合酶及其应用。本发明专利技术改造腈水合酶的获得方法为：如序列表SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的α亚基的133位Pro和如序列表SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的β亚基的215位Asp分别置换为Cys，使两个亚基之间形成二硫键。本发明专利技术改造腈水合酶的抗逆性、耐热性和产物耐受性都有显著提升，并且没有导致腈水合酶活性的降低。改造腈水合酶可催化获得高浓度丙烯酰胺产物，且可以多批次回用。

Nitrile hydratase and its application

The invention discloses a modified nitrile hydratase and belongs to the technical field of enzyme engineering and industrial microorganism and the application thereof. The modification of nitrile hydratase method: 215 Asp 133 Pro subunits such as SEQ ID sequence table NO:2 shows the amino acid sequence and the sequence table SEQ ID as NO:1 the amino acid sequence of the beta subunit of Cys were replaced, so that the formation of disulfide bonds between two and two a subunit. The invention improves the resistance, heat resistance and product tolerance of nitrile hydratase, and does not lead to reduction of nitrile hydratase activity. Transformation of nitrile hydratase can catalyze the production of high concentration acrylamide products and can be reused in batches.

【技术实现步骤摘要】
一种改造腈水合酶及其应用
本专利技术属于酶工程和工业微生物
，具体涉及一种改造腈水合酶及其应用。
技术介绍
微生物生产的腈水合酶可以高效催化丙烯腈水合生成丙烯酰胺。丙烯酰胺聚合产生的聚丙烯酰胺在三次采油、水处理、造纸等工业生产领域具有非常广泛的应用。利用微生物产生的腈水合酶催化生产丙烯酰胺具有一系列优点，包括反应在常温常压下进行、能耗低、操作简单、安全、丙烯腈转化率高、产物浓度和纯度高等，因此逐渐成为丙烯酰胺生产的主要方法。微生物法生产丙烯酰胺的研究重点在于高产腈水合酶菌株的发现和改造以及对腈水合酶本身性能的基因工程改造。其中，在基因工程方面，日本三菱化成株式会社对来自根瘤菌属的腈水合酶基因和蛋白申请了专利《具有腈水合酶活性的新型蛋白和编码该蛋白的基因》(申请号：93106122.9)；三井化学株式会社对来自嗜热假诺卡氏菌JCM3095的腈水合酶的蛋白以及编码它的基因申请了专利《参与活化腈水合酶的蛋白以及编码它的基因》(专利号：ZL99106291.4)；《新型腈水合酶》(专利号：02156180.X)，并研究了该基因在重组大肠杆菌中的表达；德国底古萨股份公司申请了《红球菌属的腈水合酶》(申请号：200580008206.8)；清华大学公开了“一种腈水合酶及其编码基因与应用”，构建了α亚基起始密码子突变的腈水合酶，并在大肠杆菌中高活性表达(专利号：ZL200410042576.0)；清华大学在专利“一种腈水合酶基因簇及其应用”中公开了红色(赤)红球菌RhodococcusruberTH中与腈水合酶高表达相关的结构基因和调控基因序列(专利号：ZL200910076710.1)。除了产物/底物耐受性外，在微生物法生产丙烯酰胺的催化水合过程中，制约生产效率的另一个主要问题就是产酶细胞的耐热性较差，水合温度必须通过低温制冷剂控制在15-22℃。由于腈水合酶催化丙烯腈水合生成丙烯酰胺是强放热反应，工业生产中控温的冷量经常供应不足，导致水合温度波动到25℃以上。较高的水合温度一方面会加快反应速率，提高生产效率，另一方面则会造成腈水合酶的快速失活，减少反应批次，增加生产成本。日本三菱丽阳株式会社公开了专利《改良型腈水合酶》(公开号：CN1961072A)，对腈水合酶β亚基第93位、第167位和219位氨基酸残基进行定点突变，提高了腈水合酶的热稳定性；清华大学在专利“一种突变腈水合酶”中对腈水合酶β亚基的141位Ser、143位Ser、144位Leu进行置换，使得腈水合酶的耐热性、产物耐受性和超声耐受性都有显著提升(专利号：ZL201110415465X)。
技术实现思路
本专利技术为了提高腈水合酶的抗逆性、耐热性和产物耐受性，提出一种改造腈水合酶及其应用。具体技术方案如下：一种改造腈水合酶通过将原腈水合酶的α亚基第215位氨基酸和β亚基第133位氨基酸之间形成二硫键改造而成。进一步地，所述原腈水合酶的α亚基的氨基酸序列如序列表SEQIDNO:2所示氨基酸序列；所述原腈水合酶的β亚基的氨基酸序列如序列表SEQIDNO:1所示氨基酸序列。进一步地，所述二硫键形成的方法为：将SEQIDNO:1所示氨基酸序列的215位Asp置换为Cys，将SEQIDNO:2所示氨基酸序列的133位Pro置换为Cys。一种编码上述改造腈水合酶的基因。进一步地，所述改造腈水合酶的基因序列如SEQIDNO:3所示。一种含有所述改造腈水合酶基因的表达载体。进一步地，所述表达载体优选质粒。进一步地，所述启动子为原核生物启动子，包含但不限于如Pami，Pa2，Ptac，PlacZ启动子(刘昌春等.红球菌启动子识别及β-半乳糖苷酶报告基因表达.生物工程学报,2009,25(9):1360-1365.)。一种含有所述改造腈水合酶基因或含有所述表达载体的转化体。进一步地，所述转化体的构建方法为：将含有权利要求4所述改造腈水合酶基因直接插入受体菌的染色体，或采用氯化钙法或电穿孔转化法将含有权利要求6所述改造腈水合酶基因的表达载体导入受体菌。进一步地，所述受体菌为大肠杆菌、红球菌、诺卡氏菌或丙酸棒杆菌。进一步地，所述转化体在制备丙烯酰胺中的应用。上述改造腈水合酶在制备丙烯酰胺中的应用。本专利技术的有益效果：1、本专利技术改造腈水合酶的抗逆性、耐热性和产物耐受性都有显著提升，并且没有导致腈水合酶活性的降低。在60℃高温下浸泡10min，改造后腈水合酶的残留酶活是改造前腈水合酶残留酶活的2.35倍；在高浓度丙烯酰胺溶液的浸泡下，改造后腈水合酶的残留酶活是改造前腈水合酶残留酶活的2.12倍。2、改造腈水合酶可催化获得高浓度丙烯酰胺产物，并且可以多批次回用。在利用丙烯腈生产丙烯酰胺的过程中，改造后腈水合酶可催化生产62％高浓度丙烯酰胺，而改造前腈水合酶仅可催化生成50％丙烯酰胺；在利用腈水合酶催化生产50％丙烯酰胺的批次反应过程中，改造后腈水合酶可实现连续4批次回用，而改造前腈水合酶仅可用1次，改造后腈水合酶综合性能优势明显，具有良好的工业应用前景。附图说明图1为改造前、后腈水合酶的活性比较。图2为改造前、后腈水合酶的热稳定性比较。图3为改造前、后腈水合酶的丙烯酰胺耐受性比较。图4为改造前、后腈水合酶催化丙烯腈生成高浓度丙烯酰胺比较。图5为改造后腈水合酶SBMDB生产得到的高浓度丙烯酰胺。图6为改造后腈水合酶催化丙烯腈水合生成丙烯酰胺批次反应中丙烯酰胺浓度变化。图7为改造后腈水合酶催化丙烯腈水合生成丙烯酰胺批次反应中电导率值变化。具体实施方式以下实施例便于更好地理解本专利技术，但不仅限于此。以下实验方法如无特殊说明均为常规方法；实验试剂如无特殊说明均可从商业途径获得。实施例1：改造后腈水合酶SBMDB基因置换过程(1)以质粒pNV-SBM(陈杰等，耦合末端盐桥与定点突变的重组腈水合酶催化动力学.化工学报，2014，65(7)：2821-2828)为模板，采用反向聚合酶链式反应(PCR)方法进行基因突变。首先对腈水合酶SBM的β亚基引入置换Aspβ215Cys。采用正向引物SBM-beta215-sense：TGTGTAGTGTGCGTCGATCTCTG；反向引物SBM-beta215-anti：TTTCCCGTTTCCGTCGTCG。PCR反应体系为：反应条件为：所得PCR扩增产物利用OMEGAbiotek公司生产的E.Z.N.A.GelExtractionKit凝胶回收试剂盒回收，回收过程按照说明书所述过程完成。所得DNA片段进行磷酸化反应，磷酸化反应体系为：反应条件为37℃，30min。所得磷酸化产物利用OMEGAbiotek公司生产的E.Z.N.A.GelExtractionKit凝胶回收试剂盒进行纯化，纯化过程按照说明书所述过程完成。纯化片段利用T4DNA连接酶在4℃进行连接反应16h；再将连接反应产物转化宿主菌E.coliBL21(DE3)的感受态细胞(天根生化科技有限公司)，采用卡那霉素抗性(Kan)LB固体培养基平板，挑选阳性克隆，所得重组质粒送铂尚生物科技公司进行DNA测序验证。LB培养基组成为：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，卡那霉素，50mg/L，琼脂粉，15g/L，pH7.0。以上述所得重组质粒为模板，继续对腈水合酶α亚基引入置换本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种改造腈水合酶，其特征在于，通过将原腈水合酶的α亚基第215位氨基酸和β亚基第133位氨基酸之间形成二硫键改造而成。

【技术特征摘要】
1.一种改造腈水合酶，其特征在于，通过将原腈水合酶的α亚基第215位氨基酸和β亚基第133位氨基酸之间形成二硫键改造而成。2.根据权利要求1所述的改造腈水合酶，其特征在于，所述原腈水合酶的α亚基的氨基酸序列如序列表SEQIDNO:2所示氨基酸序列；所述原腈水合酶的β亚基的氨基酸序列如序列表SEQIDNO:1所示氨基酸序列。3.根据权利要求1或2所述的改造腈水合酶，其特征在于，所述二硫键形成的方法为：将SEQIDNO:1所示氨基酸序列的215位Asp置换为Cys，将SEQIDNO:2所示氨基酸序列的133位Pro置换为Cys。4.一种编码权利要求1-3任一项所述改造腈水合酶的基因。5.根据权利要求4所述的改造腈水合酶的基因，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：于慧敏，焦松，张婧，沈忠耀，
申请(专利权)人：清华大学，
类型：发明
国别省市：北京,11