一种快速鉴别人甲状旁腺的方法技术

本发明专利技术公开一种快速鉴别人甲状旁腺的方法，其以甲状旁腺激素(PTH)荧光免疫层析试纸测定待测液中PTH含量的方式实现，该试纸通过双抗体夹心法和荧光免疫层析技术检测人PTH，所述抗体是利用特定的抗原表位肽制备获得。本发明专利技术能够准确地检测待测物中的人PTH，操作简便、快速，检测范围宽、特异性高、灵敏度好。

A method for rapid identification of human parathyroid glands

The invention discloses a method for rapid identification of parathyroid glands, the parathyroid hormone (PTH) fluorescence immunochromatographic strip for determining the content of PTH in the solution way, the paper through the detection of double antibody sandwich method and fluorescence immunochromatographic technique PTH, the antibody is the use of a specific epitope peptide preparation obtained. The invention can accurately detect the human PTH in the object to be measured, and the operation is simple and fast, the detection range is wide, the specificity is high, and the sensitivity is good.

【技术实现步骤摘要】
一种快速鉴别人甲状旁腺的方法
本专利技术属于免疫检测领域，具体涉及一种快速鉴别人甲状旁腺的方法。
技术介绍
甲状腺癌是头颈部最常见的恶性肿瘤，也是近年来发病率增长速度最快的恶性肿瘤之一，甲状腺癌已经成为女性第五大常见恶性肿瘤。甲状腺癌的治疗主要以外科手术治疗为主，行甲状腺全切术后应尽快确定甲状旁腺功能情况，采取针对性措施进行防治甲状旁腺功能减退。手术时如果意外切除了甲状旁腺，患者的血钙浓度会明显降低，引发手足抽搐，甚至危及生命。文献报道甲状腺术后暂时性低钙血症的发生率为0.3～86％，永久性的低钙血症为0～13％。PTH是由甲状旁腺主细胞分泌，具有调节和保持血清钙在正常水平的作用。如何在手术过程中有效避免损伤甲状旁腺是一大难题。甲状旁腺术中保护技术包括甲状旁腺的识别、精细化甲状旁腺保护操作技术、补救性甲状旁腺自体移植技术三方面。甲状旁腺的识别是术中甲状旁腺保护最关键的一步。由于甲状旁腺体体积小，其周围有甲状腺、脂肪、淋巴结、胸腺、肌肉等组织，在术中辨认存在困难。即使有经验的外科医生肉眼识别的准确率也只有近70％，甲状腺术中存在高达9～19％的甲状旁腺意外切除率。目前冰冻病理仍是鉴别甲状旁腺的金标准。但这需要切除部分甲状旁腺组织，术中等待时间长，费用贵，还存在1.3％错误率，细针穿刺组织洗脱液的甲状旁腺激素(PTH)检测，用于术前和术中鉴别甲状旁腺的方法，已有文献报道。多项研究表明甲状旁腺穿刺组织洗脱液的PTH值明显高于非甲状旁腺组织，通过细针穿刺组织洗脱液的PTH检测在术中鉴别甲状旁腺组织，操作简单，敏感性和特异性高，并十分安全。目前PTH的检测一般是通过电化学发光进行，需大型的检测设备，检测时间加上运送时间需半小时以上，如此推广应用有难度。免疫层析技术是出现于80年代初期的一种独特的免疫分析方式，它通常以条状纤维层析材料为固相，通过毛细作用使样品溶液在层析条上泳动，并同时使样品中的待测物与层析材料上针对待测物的受体(如抗体或抗原)发生高特异高亲和性的免疫反应，层析过程中免疫复合物被富集或截留在层析材料的一定区域(检测带)，通过酶反应或直接运用可目测的标记物(如胶体金)而得到直观的实验结果(如显示出不同的颜色)。而游离标记物则越过检测带，达到与结合标记物自动分离之目的。免疫层析技术常见的示踪标记粒子有胶体金，乳胶，胶体硒、明胶等，其中运用最成功的标记物为胶体金。但是，胶体金免疫层析试纸条存在以下缺陷：(1)胶体金标记过程是静电吸附过程，是一种物理吸附，故在液相中稳定性较差，往往造成已标记上的蛋白分子又再次脱落。(2)检测结果通过显示单一的紫红色条带来判断，颜色单一，难以实现多检和联检。(3)只有当金颗粒集聚到一定量时，人肉眼才能观察到紫红的条带，且该颜色条带与背景对比度不大，从而限制了检测灵敏度。(4)不同的材料基质效应明显，背景干扰非常大。(5)检测灵敏度较低。(6)无法实现定量检测。目前也出现了利用量子点标记快速免疫层析试纸条的检测方法，但是此方法并不能实现对检测物的定量检测。此外，在检测PTH水平的免疫测定方法中，尚缺乏能够在双抗体夹心测定中可高灵敏、高特异性检测的组合，寻找更为合适的具有免疫原性的PTH抗原表位肽、制备特异性的PTH抗原及抗体也是需要解决的重点。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是克服现有技术存在的上述不足，提供一种高灵敏度和高特异性，批内、批间误差小、操作简单、成本低的快速鉴别人甲状旁腺的方法。具体地，提供一种快速鉴别人甲状旁腺的方法，其包括以下步骤：1)将离体疑似甲状旁腺组织用注射器针头细针穿刺取样，取样后针头后方连接注射器；2)取含PBS缓冲液的溶液管，平衡至室温，将细针穿刺后的注射器伸入缓冲液中，通过抽吸方式充分洗涤混匀，制成待测样品；3)在人甲状旁腺激素(PTH)荧光免疫层析试纸的加样区加入上述待测样品，于孵化器中薄膜层析反应；4)将反应后的荧光免疫层析试纸及校准卡插入便携式荧光免疫定量分析仪的插卡口，运行仪器，仪器自动读卡给出荧光免疫层析试纸中的质控带C值和检测带T值；5)当C<10000时，表示结果为无效检测，需要重新更换试纸检测；当T/C≥0.2时，结果为阳性，表明穿刺物为甲状旁腺组织；当T/C<0.2时，结果为阴性，表明穿刺物非甲状旁腺组织。优选地，步骤1)中的穿刺次数为3次，注射器针头为26-gague，注射器体积为1ml。优选地，步骤2)中溶液管中PBS缓冲液体积为200μl，步骤3)加入待测样品的体积为60μl。优选地，所述荧光免疫层析试纸通过双抗体夹心法和荧光免疫层析技术检测人PTH，其中：所述双抗体夹心法采用标记有荧光微球的第一PTH单克隆抗体作为检测抗体，所述第一PTH单克隆抗体利用人PTH抗原表位肽(1)和(2)中的一个作为抗原制备获得；并且所述双抗体夹心法采用第二PTH单克隆抗体作为捕获抗体，所述第二单克隆抗体利用人PTH抗原表位肽(1)和(2)中的另一个作为抗原制备获得；所述人PTH抗原表位肽(1)和(2)分别为：(1)：ERVEWLRKKLQ(SEQIDNO：2)(2)：RKKEDNVLVESHEKSLGEAD(SEQIDNO：3)。进一步地，所述单克隆抗体是由PTH抗原表位肽与载体蛋白偶联制备而成的抗原制备而得。优选地，所述荧光微球上的荧光物质为稀土离子铕；优选地，所述荧光微球的微球材料为聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯或甲基丙烯酸甲酯的共聚物。优选地，所述试纸具有底板，并且在该底板上沿使用时的层析方向依次以接触方式设置有：样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水纸，所述结合垫设置有所述标记有荧光微球的第一PTH单克隆抗体，所述硝酸纤维素膜包括检测带和质控带，所述检测带包被有所述第二PTH单克隆抗体，所述质控带固定有能与所述标记有荧光微球的第一PTH单克隆抗体特异性结合的抗抗体。优选地，所述底板不具有荧光性质。优选地，所述抗抗体为羊抗鼠IgG单克隆抗体或兔抗鼠IgG单克隆抗体。进一步地，本专利技术还提供一种制备所述荧光免疫层析试纸的方法，其包括以下步骤：1)提供标记有荧光微球的第一PTH单克隆抗体；2)提供结合垫，其中在所述结合垫上结合有所述标记荧光微球的第一PTH单克隆抗体；3)提供硝酸纤维素膜，其中在所述硝酸纤维素膜上沿使用时的层析方向间隔固定第二PTH单克隆抗体和抗抗体，以分别形成检测带和质控带；4)在底板上沿使用时的层析方向依次以接触方式设置样品垫、所述结合垫、所述硝酸纤维素膜、吸水纸，从而制成所述荧光免疫层析试纸。所述步骤1)包括：使用pH7.2-7.6的MES活化缓冲液洗涤荧光微球，加入碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，室温反应一定时间，洗涤荧光微球，用0.05MpH7.2-7.6的磷酸盐缓冲液复溶后加入标记抗体，室温反应2小时，加入含有10％BSA的0.05MpH7.2-7.6的磷酸盐缓冲液，室温反应30分钟，洗涤荧光微球，用含有1％BSA，0.1％Tween-20，0.05MpH7.2-7.6的磷酸盐缓冲液复溶至原体积，定量喷涂于结合垫上，避光35-38℃烘干1小时，加入干燥剂封存备用。在所述步骤3)中，所述检测带和质控带间隔3mm至8mm，所述第二PTH单克隆抗体和所述抗抗体的包被浓度分别为0.5～本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种快速鉴别人甲状旁腺的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)将离体疑似甲状旁腺组织用注射器针头细针穿刺取样，取样后针头后方连接注射器；2)取含PBS缓冲液的溶液管，平衡至室温，将细针穿刺后的注射器伸入缓冲液中，通过抽吸方式充分洗涤混匀，制成待测样品；3)在人甲状旁腺激素(PTH)荧光免疫层析试纸的加样区加入上述待测样品，于孵化器中薄膜层析反应；4)将反应后的荧光免疫层析试纸及校准卡插入便携式荧光免疫定量分析仪的插卡口，运行仪器，仪器自动读卡给出荧光免疫层析试纸中的质控带C值和检测带T值；5)当C<10000时，表示结果为无效检测，需要重新更换试纸检测；当T/C≥0.2时，结果为阳性，表明穿刺物为甲状旁腺组织；当T/C<0.2时，结果为阴性，表明穿刺物非甲状旁腺组织。

【技术特征摘要】
1.一种快速鉴别人甲状旁腺的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)将离体疑似甲状旁腺组织用注射器针头细针穿刺取样，取样后针头后方连接注射器；2)取含PBS缓冲液的溶液管，平衡至室温，将细针穿刺后的注射器伸入缓冲液中，通过抽吸方式充分洗涤混匀，制成待测样品；3)在人甲状旁腺激素(PTH)荧光免疫层析试纸的加样区加入上述待测样品，于孵化器中薄膜层析反应；4)将反应后的荧光免疫层析试纸及校准卡插入便携式荧光免疫定量分析仪的插卡口，运行仪器，仪器自动读卡给出荧光免疫层析试纸中的质控带C值和检测带T值；5)当C<10000时，表示结果为无效检测，需要重新更换试纸检测；当T/C≥0.2时，结果为阳性，表明穿刺物为甲状旁腺组织；当T/C<0.2时，结果为阴性，表明穿刺物非甲状旁腺组织。2.根据权利要求1所述的快速鉴别人甲状旁腺的方法，其特征在于，步骤1)中的穿刺次数为3次，注射器针头为26-gague，注射器体积为1ml。3.根据权利要求1所述的快速鉴别人甲状旁腺的方法，其特征在于，步骤2)中溶液管中PBS缓冲液体积为200μl，步骤3)加入待测样品的体积为60μl。4.根据权利要求1所述的快速鉴别人甲状旁腺的方法，其特征在于，所述荧光免疫层析试纸通过双抗体夹心法和荧光免疫层析技术检测人PTH，其中：所述双抗体夹心法采用标记有荧光微球的第一PTH单克隆抗体作为检测抗体，所述第一PTH单克隆抗体利用人PTH抗原表位肽(1)和(2)中的一个作为抗原制备获得；并且所述双抗体夹心法采用第二PTH单克隆抗...

【专利技术属性】
技术研发人员：邹贤，朱利国，程晓青，范俊，朱国华，戴军，包建东，高芸，王国瑞，孙志强，李秀龙，周彬，曹亚琴，杨克勤，
申请(专利权)人：江苏省原子医学研究所，
类型：发明
国别省市：江苏,32