本发明专利技术涉及检测SMAD4基因V354L位点突变的试剂盒，包括：检测SMAD4基因V354L(c.1060G>C)位点突变的特异引物，所述特异性引物的上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述特异引物的下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明专利技术首次揭示了SMAD4基因V354L(c.1060G>C)位点突变与接受辅助性化疗的非小细胞肺癌患者预后密切相关，并根据该发现设计出检测试剂盒，为非小细胞肺癌患者个体化的辅助性化疗提供指导。
Kit for detecting V354L mutation of SMAD4 gene
The invention relates to a kit for detecting SMAD4 gene mutation of V354L include: detection of SMAD4 gene V354L (c.1060G> C) mutation specific primers, the specific primers of the upstream primer nucleotide sequence of SEQ ID NO.1 shows, the downstream primer nucleotide sequence specific primers as shown in SEQ ID NO.2. The present invention first revealed SMAD4 gene V354L (c.1060G> C) mutation is closely related with the prognosis of NSCLC patients received adjuvant chemotherapy, and according to the found design kit provides guidance for adjuvant chemotherapy in patients with non-small cell lung cancer individualized.
【技术实现步骤摘要】
检测SMAD4基因V354L位点突变的试剂盒
本专利技术涉及一种检测SMAD4基因V354L位点突变的试剂盒，属于生物技术和医学
技术介绍
SMAD4是一种抑癌基因，常见于胰腺癌和结肠癌。转化生长因子β(TGF-β)调节着细胞生长、分化以及多种生理、病理过程，TGF-β与SMAD4构成的信号通路与肿瘤的发生机制密切相关，SMAD4在该信号通路中发挥着核心作用。相关研究发现，SMAD4基因的缺失或突变与肿瘤细胞的侵袭、淋巴结转移以及肿瘤血管形成密切相关。SMAD4基因的缺失还可以促进肺癌的发生与发展，当SMAD4基因被敲除后，肺癌细胞对DNA拓扑异构酶抑制剂的敏感性增强。Taqman探针是一种荧光检测技术，用含有特异序列的荧光标记探针来检测PCR产物，Taqman探针的出现使得定量PCR技术的特异性有了很大提高。该特异性的荧光探针在两条引物之间与模板特异性地结合。在探针的5’端标记有荧光报告基团如FAM、VIC等，在探针的3’端标记荧光淬灭基团。当探针完整时，仪器检测不到荧光信号，因为报告基团发射的荧光信号会会被淬灭基团吸收；在PCR扩增过程中，TaqDNA聚合酶会酶切降解与模板相结合的探针，导致3’端淬灭基团与5’端报告基团分离，仪器就可以检测到荧光信号。目前专利技术一种能够快速检测患者SMAD4基因V354L(c.1060G>C)位点突变的方法，进而有助于指导非小细胞肺癌患者辅助性化疗方案的选择，成为急需解决的问题。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术在检测SMAD4基因V354L(c.1060G>C)位点突变时所表现出的缺点，提供一种准确、快速、廉价的检测SMAD4基因V354L(c.1060G>C)位点突变的试剂盒。专利技术概述专利技术人采用二代高通量测序技术检测到SMAD4基因V354L(c.1060G>C)突变位点，并通过统计学方法分析发现了接受辅助性化疗的肺癌患者的预后与SMAD4基因V354L(c.1060G>C)位点突变密切相关。在所有检测到SMAD4基因V354L(c.1060G>C)位点突变的IIBorIIIA期非小细胞肺癌患者中，接受卡铂联合多西他赛的辅助性化疗方案相比于卡铂联合长春瑞滨，患者的无病生存期(DFS)以及总生存期(OS)显著延长。然而在所有SMAD4基因该位点没有发生突变的IIBorIIIA期非小细胞肺癌患者中，卡铂联合多西他赛方案或者卡铂联合长春瑞滨方案，对患者预后的影响无统计学差异。根据上述发现，专利技术人根据实时荧光定量PCR检测方法，设计出一种检测SMAD4基因V354L(c.1060G>C)位点突变的试剂盒，该试剂盒能够准确、快速地检测SMAD4基因该位点的突变，并且操作较为简便，成本相对廉价。专利技术详述检测SMAD4基因V354L位点突变的试剂盒，包括：检测SMAD4基因V354L(c.1060G>C)位点突变的特异性引物，所述特异性引物的上游核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，下游核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。根据本专利技术优选的，上述试剂盒，还包括：特异性识别SMAD4基因V354L(c.1060G>C)突变位点的Taqman探针，所述Taqman探针的野生型序列如SEQIDNO.3所述，突变型Taqman探针序列如SEQIDNO.4所示；根据本专利技术优选的，上述试剂盒，还包括：缓冲液，dNTPs，TaqDNA聚合酶，MgCl2和DNA提取试剂盒。根据本专利技术优选的，上述试剂盒，反应在20μL体系中进行，各成分反应浓度如下：引物0.2μM、Taqman探针0.1μM、dNTPs0.25mM、TaqDNA聚合酶0.025U/μL、MgCl21.5mM、DNA提取试剂盒提取到的模板DNA<250ng。根据本专利技术优选的，所述野生型Taqman探针的5′端连接VIC荧光标记；突变型Taqman探针的5′端连接FAM荧光标记。有益效果1、本专利技术首次发现了SMAD4基因V354L(c.1060G>C)位点突变与接受辅助性化疗的非小细胞肺癌患者的预后密切相关，并根据该发现设计出检测SMAD4基因V354L(c.1060G>C)位点突变的试剂盒，有助于为非小细胞肺癌患者术后的辅助性化疗提供个体化指导；2、本专利技术所述的试剂盒采用实时荧光定量PCR技术，在检测SMAD4基因V354(c.1060G>C)位点突变上，相比现有二代高通量测序技术，该试剂盒具有操作简单、时间短、价格低廉的特点，并且该试剂盒实用范围广，所检测的DNA可以提取自新鲜组织、外周血以及石蜡切片样本。附图说明图1是用本专利技术所述试剂盒检测SMAD4基因V354L(c.1060G>C)位点野生型的检测结果；图中：虚线为VIC荧光基团在野生型探针5′端上所发荧光；图2是用本专利技术所述试剂盒检测SMAD4基因V354L(c.1060G>C)位点突变型的检测结果；图中：实线为FAM荧光基团在突变型探针5′端上所发荧光。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术的技术方案做进一步阐述，但本专利技术所保护范围不限于此。实施例中DNA提取试剂盒包括：GeneReadTMDNAFFPEKit购自QIAGEN公司；TIANampGenomicDNAKit购自TIANGEN公司。TaqDNA聚合酶等其他试剂均购自大连宝生物公司。实施例1专利技术人采用二代高通量测序技术检测到SMAD4基因V354L(c.1060G>C)突变位点，并通过统计学方法分析发现了接受辅助性化疗的肺癌患者的预后与SMAD4基因V354L(c.1060G>C)位点突变密切相关。在所有SMAD4基因该位点没有发生突变的IIBorIIIA期非小细胞肺癌患者中，卡铂联合多西他赛方案或者卡铂联合长春瑞滨方案，对患者预后的影响无统计学差异。但是在所有检测到SMAD4基因V354L(c.1060G>C)位点突变的IIBorIIIA期非小细胞肺癌患者中，接受卡铂联合多西他赛的辅助性化疗方案相比于卡铂联合长春瑞滨，患者的无病生存期(DFS)以及总生存期(OS)显著延长。具体研究过程如下：入组病例：专利技术人回顾性地调查了从2010年2月至2012年7月在山大二院就诊的非小细胞肺癌患者，根据入组标准，最终确定一批IIBorIIIA期非小细胞肺癌入组本研究，入组肺癌患者均有明确的临床病理特征和完整的术后随访信息，且所有患者术后均接受了辅助性化疗，方案为卡铂联合多西他赛或者长春瑞滨。研究方法：采用二代高通量测序技术对上述肿瘤组织进行基因测序，步骤包括：①应用DNA提取试剂盒GeneReadTMDNAFFPEKit从石蜡切片标本中提取DNA并进行定量；②根据提取的DNA建立IonAmpliSeqTM文库；③进行IonPGMTMHi-QTM测序及数据分析。研究结果：在33.3％的病人中检测到了SMAD4基因V354L(c.1060G>C)位点突变，专利技术人通过Kaplan-Meier分析法发现：在所有检测到SMAD4基因V354L(c.1060G>C)位点突变的IIBorIIIA期非小细胞肺癌患者中，接受卡铂联合多西他赛的辅助性化疗方案相比于卡铂联合长春瑞滨，患者的无病生存期(DFS)以及总本文档来自技高网...
【技术保护点】
检测SMAD4基因V354L位点突变的试剂盒，其特征在于，包括：检测SMAD4基因V354L(c.1060G>C)位点突变的特异性引物，所述特异引物的上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述特异引物的下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
【技术特征摘要】
1.检测SMAD4基因V354L位点突变的试剂盒，其特征在于，包括：检测SMAD4基因V354L(c.1060G>C)位点突变的特异性引物，所述特异引物的上游引物核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，所述特异引物的下游引物核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，还包括：特异性识别SMAD4基因V354L(c.1060G>C)位点突变的Taqman探针，所述Taqman探针的野生型核苷酸序列如SEQIDNO.3所述，Taqman探针的突变型核苷酸序列如SEQIDNO.4所示。3.如权利要求1所述的试剂...
【专利技术属性】
技术研发人员：赵小刚，唐东起，王文娟，李培超，
申请(专利权)人：山东大学第二医院，
类型：发明
国别省市：山东,37
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