一种儿童白血病相关融合基因多重PCR检测试剂盒及方法技术

本发明专利技术提供一种儿童白血病相关融合基因多重PCR检测试剂盒及方法，所述的试剂盒包括用于扩增8种儿童白血病相关融合基因CBFB‑MYH11、SIL‑TAL1、TEL‑AML1、BCR‑ABL、E2A‑PBX1、PML‑RARa、AML1‑ETO、MLL‑AF4的嵌合引物、用于扩增内标的嵌合引物IC及通用引物，本发明专利技术提供的试剂盒可一次性检测8种儿童白血病相关融合基因，降低检测成本，节省检测时间，适合儿童白血病患者的常规筛检，而且扩增通量和检测灵敏度较高；并且本发明专利技术采用特异性的引物序列，保证检测结果的可靠性、该检测方法操作简单、省时省力、检测通量大、试剂耗材成本低，可直接对儿童白血病患者外周血样本提取的核酸进行检测；对检测平台和人工技术水平要求低，能够在常规筛查和检测中广泛推广。

Multiple PCR detection kit and method for fusion gene of leukemia in children

The invention provides a children's leukemia associated fusion gene by multiplex PCR detection kit and method, the kit includes 8 children for amplification of leukemia associated fusion gene CBFB MYH11, SIL TAL1, TEL AML1, BCR ABL, E2A PBX1, PML RARa, AML1 ETO, MLL AF4 the chimeric primers for amplification of the internal standard, the chimeric primers IC and universal primer kit provided by the invention can be 8 kinds of childhood leukemia fusion gene single detection, reduce testing costs, shorten the detection time, suitable for routine screening of children with leukemia, and amplification of flux and high sensitivity; and the invention adopts the primer sequence specificity, reliability, test results of the detection method is simple, time-saving, high flux, detection reagent and low cost, can be directly on the children with leukemia The nucleic acid extracted from peripheral blood samples of patients is low, and the detection platform and manual technology level is low, so it can be widely popularized in routine screening and detection.

【技术实现步骤摘要】
一种儿童白血病相关融合基因多重PCR检测试剂盒及方法
本专利技术涉及一种检测试剂盒
，尤其是一种儿童白血病相关融合基因多重PCR检测试剂盒及方法。
技术介绍
白血病是儿童最常见的恶性肿瘤，其中急性淋巴细胞白血病(AcuteLymphoblasticLeukemia，ALL)约占80％左右，儿童中人群发病率达到0.3～0.4/万人，迄今为止，报道涉及白血病相关的染色体易位、倒位形成的融合基因达50多种,包括t(9；22)、t(12；21)、t(1；19)、t(4；11)、t(9；9)、t(16；21)等，常见的儿童白血病相关融合基因主要有t(12；21)易位形成的TEL-AML1融合基因、t(1；19)易位形成的E2A-PBX1融合基因、t(4；11)易位形成的MLL-AF4融合基因、t(9；22)易位形成的m-BCR-ABL融合基因、t(8；21)易位形成的AML1-ETO融合基因、t(15；17)易位形成的PML-RARα融合基因、inv(16)/t(16；16)倒位形成的CBFβ-MYH11融合基因；其中，前4种是儿童ALL相关的主要融合基因，白血病相关融合基因是白血病特异性的分子标志物之一，是儿童白血病疾分型的独立指征。目前，国内外对融合基因检测常用的方法主要包括白血病细胞染色体核型分析、染色体荧光原位杂交(FluorescentInSituHybridazation,FISH)技术以及聚合酶链式反应技术(PolymeraseChainReaction,PCR)。染色体G显带核型分析技术的阳性率主要依赖于待检白血病细胞的增生率，常常受到检测技术条件和人为操作因素的影响，每份检测标本需要至少分析10-30个分裂中期细胞，而且由于样本中的细胞也并非都是均一的肿瘤细胞，因此当细胞量过少时则不能进行核型分析，同时某些复杂性染色体易位的辨认在技术上存在一定的困难(XULiXia,2009)，但核型分析技术在检测缺失和数目畸变等染色体异常方面具有优势，是检测ALL患者染色体异常必不可少的手段；染色体荧光原位杂交技术是根据核酸碱基互补配对原理，用半抗原标记的DNA或者RNA探针与变性的单链核酸序列互补配对，通过带有荧光基团的抗体去识别半抗原进行检测，或用荧光基团对探针直接标记并与目标序列结合，最后利用荧光显微镜直接观察目标序列在细胞核、染色体或切片组织中的分布情况(HEShi-Bin,2014；KrauterJ,1998)，FISH技术发展早期，是应用放射性同位素标记探针，荧光原位杂交检测融合基因技术是20世纪80年代末期在放射性原位杂交的基础上发展起来的一种非放射性原位杂交技术，该技术具有检测信号强、杂交特异性高以及能够多重染色标记等特点，被广泛应用于基因定位、染色体识别、物理图谱的构建、进化分析等研究中。但由于荧光探针价格昂贵、实验操作较为繁琐、并且不能够进行批量标本检测，因此该技术在临床中的应用也受到了一定程度的限制。聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction,PCR)是利用DNA在体外95℃高温时变性会变成单链，低温(经常是60℃左右)时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度(72℃左右)，DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链，设计与模板DNA两条互补链分别互补配对的两条引物，可对引物之间的DNA片段进行体外扩增。PCR检测技术灵敏度高、特异性强、操作简单，其已经成为基因诊断有效而且敏感的方法，在白血病相关融合基因的检测方面具有无可比拟的优势，目前白血病融合基因检测的研究倾向于PCR技术，扩增产物经过测序还可以得到序列信息(Natini,2009)，这对情况复杂的融合基因研究很有帮助，荧光定量PCR通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析。Sharon通过荧光定量PCR检测急性淋巴细胞白血病，利用荧光探针和两个引物同时确定一条扩增片段，灵敏度和特异性都很高(Sharon,2005)。但是对于越来越多的新的白血病融合基因断裂位点，就意味着多变的扩增片段长度，想要覆盖尽可能多的融合情况，片段长度变化范围很大，但荧光定量PCR扩增片段最好在200bp以内，因此只能检测常见类型，目前针对融合基因的荧光PCR检测多为单个融合基因。目前采用多重PCR方法检测白血病融合基因有少量报道，多重PCR(multiplexPCR)，又称多重引物PCR，是将二对或以上的特异性引物加入同一PCR反应体系中，同时扩增一个样本中的不同靶基因，具有高效性、系统性、准确性和经济简便的优点，符合临床对分子诊断技术的要求，如同时筛选可划分儿童ALL危险度的染色体易位，包括t(I；I9)、t(4；II)、t(9；22)、t(I2；2I)等，Fei等人首先利用多重RT-PCR扩增，再将扩增产物与不同通道的荧光探针杂交，最后经过流式细胞仪就可检测到与探针结合的PCR片段，从而检测到相应的融合基因(FeiYe,2012)，但整个过程也需要5-6个小时，时间相对较长，并且由于多重PCR是在同一PCR反应体系里加入多对引物以扩增多个DNA片段的PCR反应，因此同一反应体系中的多对引物易发生相互作用，如形成发卡结构，二聚体结构等，引物对和引物量越多，引物之间的相互作用越明显，从而影响PCR扩增效率，进而影响了多重PCR的广泛应用。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术提供一种特异性强、灵敏度高、通量高的儿童白血病相关融合基因多重PCR检测试剂盒及方法，该试剂盒能够一次性检测儿童白血病患者外周血样本中的8种儿童白血病相关融合基因CBFB-MYH11、SIL-TAL1、TEL-AML1、BCR-ABL、E2A-PBX1、PML-RARa、AML1-ETO和MLL-AF4，从而实现多重检测。为解决上述技术问题，本专利技术采用如下技术方案：一种儿童白血病相关融合基因多重PCR检测试剂盒，包括以下引物对：(1)检测CBFB-MYH11基因的嵌合引物：CBFB-MYH11_F，其核苷酸序列如SEQIDNO：1所示；CBFB-MYH11_R，其核苷酸序列如SEQIDNO：2所示；(2)检测SIL-TAL1基因的嵌合引物：SIL-TAL1_F，其核苷酸序列如SEQIDNO：3所示；SIL-TAL1_R，其核苷酸序列如SEQIDNO：4所示；(3)检测TEL-AML1基因的嵌合引物：TEL-AML1_F，其核苷酸序列如SEQIDNO：5所示；TEL-AML1_R，其核苷酸序列如SEQIDNO：6所示；(4)检测BCR-ABL基因的嵌合引物：M-bcr_F，其核苷酸序列如SEQIDNO：7所示；m-bcr_F，其核苷酸序列如SEQIDNO：8所示；bcr_R，其核苷酸序列如SEQIDNO：9所示；(5)检测E2A-PBX1基因的嵌合引物：E2A-PBX1_F，其核苷酸序列如SEQIDNO：10所示；E2A-PBX1_R，其核苷酸序列如SEQIDNO：11所示；(6)检测PML-RARa基因的嵌合引物：PML-RARa_F，其核苷酸序列如SEQIDNO：12所示；PML-RARa_R，其核苷酸序列如SEQIDNO本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种儿童白血病相关融合基因多重PCR检测试剂盒，其特征在于，包括以下引物对：(1)检测CBFB‑MYH11基因的嵌合引物：CBFB‑MYH11_F，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；CBFB‑MYH11_R，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；(2)检测SIL‑TAL1基因的嵌合引物：SIL‑TAL1_F，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；SIL‑TAL1_R，其核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；(3)检测TEL‑AML1基因的嵌合引物：TEL‑AML1_F，其核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示；TEL‑AML1_R，其核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示；(4)检测BCR‑ABL基因的嵌合引物：M‑bcr_F，其核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示；m‑bcr_F，其核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示；bcr_R，其核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示；(5)检测E2A‑PBX1基因的嵌合引物：E2A‑PBX1_F，其核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示；E2A‑PBX1_R，其核苷酸序列如SEQ ID NO：11所示；(6)检测PML‑RARa基因的嵌合引物：PML‑RARa_F，其核苷酸序列如SEQ ID NO：12所示；PML‑RARa_R，其核苷酸序列如SEQ ID NO：13所示；(7)检测AML1‑ETO基因的嵌合引物：AML1‑ETO_F，其核苷酸序列如SEQ ID NO：14所示；AML1‑ETO_R，其核苷酸序列如SEQ ID NO：15所示；(8)检测MLL‑AF4基因的嵌合引物：MLL‑AF4_F，其核苷酸序列如SEQ ID NO：16所示；MLL‑AF4_R，其核苷酸序列如SEQ ID NO：17所示；(9)内标基因的嵌合引物IC：IC_F，其核苷酸序列如SEQ ID NO：18所示；IC_R，其核苷酸序列如SEQ ID NO：19所示；(10)通用引物：Tongyong_F，其核苷酸序列如SEQ ID NO：20所示；Tongyong_R，其核苷酸序列如SEQ ID NO：21所示；上述引物在一次检测中共同使用。...

【技术特征摘要】
1.一种儿童白血病相关融合基因多重PCR检测试剂盒，其特征在于，包括以下引物对：(1)检测CBFB-MYH11基因的嵌合引物：CBFB-MYH11_F，其核苷酸序列如SEQIDNO：1所示；CBFB-MYH11_R，其核苷酸序列如SEQIDNO：2所示；(2)检测SIL-TAL1基因的嵌合引物：SIL-TAL1_F，其核苷酸序列如SEQIDNO：3所示；SIL-TAL1_R，其核苷酸序列如SEQIDNO：4所示；(3)检测TEL-AML1基因的嵌合引物：TEL-AML1_F，其核苷酸序列如SEQIDNO：5所示；TEL-AML1_R，其核苷酸序列如SEQIDNO：6所示；(4)检测BCR-ABL基因的嵌合引物：M-bcr_F，其核苷酸序列如SEQIDNO：7所示；m-bcr_F，其核苷酸序列如SEQIDNO：8所示；bcr_R，其核苷酸序列如SEQIDNO：9所示；(5)检测E2A-PBX1基因的嵌合引物：E2A-PBX1_F，其核苷酸序列如SEQIDNO：10所示；E2A-PBX1_R，其核苷酸序列如SEQIDNO：11所示；(6)检测PML-RARa基因的嵌合引物：PML-RARa_F，其核苷酸序列如SEQIDNO：12所示；PML-RARa_R，其核苷酸序列如SEQIDNO：13所示；(7)检测AML1-ETO基因的嵌合引物：AML1-ETO_F，其核苷酸序列如SEQIDNO：14所示；AML1-ETO_R，其核苷酸序列如SEQIDNO：15所示；(8)检测MLL-AF4基因的嵌合引物：MLL-AF4_F，其核苷酸序列如SEQIDNO：16所示；MLL-AF4_R，其核苷酸序列如SEQIDNO：17所示；(9)内标基因的嵌合引物IC：IC_F，其核苷酸序列如SEQIDNO：18所示；IC_R，其核苷酸序列如SEQIDNO：19所示；(10)通用引物：Tongyong_F，其核苷酸序列如SEQIDNO：20所示；Tongyong_R，其核苷酸序列如SEQIDNO：21所示；上述引物在一次检测中共同使用。2.根据权利要求1所述的一种儿童白血病相关融合基因多重PCR检测试剂盒，其特征在于：所述的多重PCR检测试剂盒还包括阳性对照、阴性对照、酶系、PCR反应缓冲液及DEPC水。3.根据权利要求2所述的一种儿童白血病相关融合基因多重PCR检测试剂盒，其特征在于：所述的阳性对照为上述8种检测靶标CBFB-MYH11、SIL-TAL1、TEL-AML1、...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱坤，陈倩，胡正，康美云，
申请(专利权)人：南京美宁康诚生物科技有限公司，北京美康基因科学股份有限公司，南京医科大学附属儿童医院，
类型：发明
国别省市：江苏,32