表达GPC3嵌合抗原受体的iNKT细胞及制备、应用制造技术

本发明专利技术公开了一种表达靶向GPC3嵌合抗原受体的iNKT细胞及其制备和应用。嵌合抗原受体为包含按串联结构域连接的识别GPC3的C末端表位的单链抗体GPC3‑ScFv、CD8的hinge区、跨膜区和胞内信号区。嵌合抗原受体修饰的iNKT细胞制备包括：构建嵌合抗原受体pRRL‑gc33‑28BBz，感染iNKT细胞，体外特异性扩增后获得针对GPC3靶向性的iNKT细胞。本发明专利技术中编码嵌合抗原受体蛋白的核酸，包括含核酸的质粒、含质粒的病毒以及病毒转导的转基因iNKT淋巴细胞可以有效地被用于肿瘤免疫治疗中。

Constant natural killer T cells expressing GPC3 targeting chimeric antigen receptor (iNKT) and their preparation and Application

The present invention discloses a iNKT cell expressing GPC3 chimeric antigen receptor and its preparation and application. Chimeric antigen receptor containing C terminal domain table according to the identification of the GPC3 series connection of scFv GPC3 ScFv and CD8 hinge region, transmembrane and intracellular signal region. By including iNKT cell chimeric antigen receptor: chimeric antigen receptor pRRL gc33 28BBz infection of iNKT cells, in vitro specificity amplification obtained after targeting GPC3 of iNKT cells. The nucleic acid encoding chimeric antigen receptor proteins, including nucleic acid containing plasmids, plasmid containing viruses, and virus transduced transgenic iNKT lymphocytes, can be effectively used in tumor immunotherapy.

【技术实现步骤摘要】
表达靶向GPC3嵌合抗原受体的恒定自然杀伤T细胞(iNKT)及其制备和应用
本专利技术涉及肿瘤生物治疗领域，具体涉及用于过继免疫治疗的，靶向表达GPC3抗原的肝癌等实体瘤的iNKT细胞及其制备和应用。
技术介绍
磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(Glypican-3，GPC3)是一种在细胞表面表达的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖。GPC3可参与细胞分裂和癌细胞的生长。GPC3蛋白通过糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定位于细胞膜上，通过被蛋白酶剪切产生可溶性的进入人体血液的氨基端肽和含有硫酸乙酰肝素(HS)糖链的膜结合羧基端肽。其剪切体可作为肿瘤抗原进行检测。GPC3蛋白在胎肝中高表达，不表达于正常成年人的肝脏以及正常组织中。GPC3在肝癌组织中高表达，而胆管细胞癌及正常的肝组织中则不表达。非肝细胞癌病例均为阴性，包括胆管癌、肝转移癌、肝细胞癌癌旁肝组织(包括肝硬化和血管瘤旁肝组织)。GPC3在黑色素瘤、卵巢透明细胞癌、卵黄囊瘤、神经母细胞瘤、肝母细胞瘤、肾母细胞瘤细胞、睾丸非精原细胞瘤、脂肪肉瘤以及胃癌的一部分特殊群体中，也具有较低程度的表达。由于GPC3在肝癌等恶性肿瘤中的高表达，以及其在正常组织中无表达，所以它被认为是肿瘤免疫治疗中一个非常好的治疗靶点。GPC3作为肝癌诊断的检测近些年已经被广泛应用，一般认为，GPC3在肝癌病人血清中的特异性和敏感性要优于其他指标。近些年的科研结果也有利用了抗GPC3抗体的方法来进行的细胞毒性研究。现在应用较多的是GC33抗体，GC33抗体识别的是GPC3蛋白的C末端。抗体作为免疫球蛋白，半衰期较短，并且随着时间的延长，需要重复给药或者加大药量才能达到肿瘤治疗的目的。嵌合抗原受体(ChimericAntigenReceptor，CAR)由识别抗原的单链抗体和不同的胞内信号结构与连接而成。通常嵌合抗原受体CAR的胞外区包含了识别肿瘤相关抗原的ScFv，跨膜区包括CD8等分子的跨膜区，胞内信号区包含免疫受体酪氨酸活化基序ITAM和CD28、CD137等共刺激分子的胞内信号区。嵌合抗原受体细胞可以利用其单链抗体对肿瘤表面相关抗原的特异性识别，从而捕获肿瘤细胞，继而通过其胞内区信号分子将识别后的信号传递到细胞内，激活淋巴细胞的杀伤毒性，从而靶向杀伤体内的肿瘤细胞。恒定自然杀伤T(invariantnaturekillerT,iNKT)细胞是一类天然存在的介导先天性免疫和获得性免疫的免疫细胞,是T淋巴细胞中独特的亚群。其表达恒定的TCRVα14与NK细胞的部分标识。iNKT细胞也被认为是经典的1型NKT细胞。iNKT细胞与多种肿瘤和自身免疫性疾病有关，在这些肿瘤患者和病人体内iNKT细胞的数量显著减少，激活iNKT细胞能显著改善肿瘤和多种疾病的症状。iNKT细胞能特异性识别APC表面非经典MHCI类分子CDld提呈的糖脂类抗原并具有产生杀伤性细胞因子的能力，从而参与各种免疫调节，如抗肿瘤、抗感染、器官移植的抗排斥以及控制自身免疫性疾病的发展。活化后的iNKT细胞分泌多种细胞因子，如IFN-γ和TNF-α等或者相关凋亡诱导配体(TRAIL)等，能够直接杀伤肿瘤细胞或者间接激活细胞毒性T细胞以及树突状细胞，从而参与不同的免疫应答。肝脏作为人体最大的免疫器官，其组织内免疫细胞成分极为复杂。已有研究证明iNKT细胞在肝脏具有较高的分布比例。小鼠体内iNKT细胞在肝脏数量较多，约占肝内T细胞总数的30-50％，并且iNKT细胞在人类及小鼠体内的分布特点几乎一致。正常人体内iNKT细胞在外周血中分布较少(约0.01％-0.1％)，而其主要分布于人体肝脏中，这也提示iNKT细胞可能在肝炎以及肝脏肿瘤疾病中起着重要作用。iNKT如此特殊的分布状态可能与其细胞表面的趋化因子受体有关。由于自身表达磷酸鞘氨醇受体(S1P1R)及多种趋化因子受体(C-X-Cchemokinereceptor)使iNKT细胞选择性转移到肝脏等实体组织。有研究表明，肝脏局部会高表达CRCR6等趋化因子受体或配体，可以募集iNKT细胞特异性地向肝脏局部趋化，从而发挥免疫功能。iNKT可以介导肿瘤免疫，并且体外增殖的iNKT细胞同样表现出较好的细胞毒效应杀伤肿瘤细胞。近年来，iNKT淋巴细胞作为针对肿瘤的过继性免疫治疗手段进行了一些相关临床实验，取得了一定的效果，α-Galcer加DC免疫或者单纯输注体外扩增后的iNKT细胞可以有效地控制肿瘤。过去临床实验中输注的iNKT细胞体外特异性扩增后，数量明显增加，针对肿瘤的杀伤性细胞因子产生也明显增多，但是由于iNKT细胞的富集是器官特异性的，这在一定程度上也会限制了iNKT细胞对肿瘤本身的靶向特异性治疗。我们通过慢病毒感染等方式，将CAR基因修饰在iNKT细胞表面，将CAR-iNKT细胞以主要组织相容性复合物(MajorHistocompatibilityComplex，MHC)以非限制性方式选择性地定向到肝脏以及肝肿瘤细胞并特异性杀伤肝癌肿瘤细胞以提高其肿瘤特异性和杀伤效率，CAR-iNKT细胞也将是肿瘤免疫治疗领域的一个新的免疫治疗策略和手段。目前为止，国内外尚无靶向GPC3的CAR-iNKT的明确方案提出。虽然WO2014201021A1中提出了一种免疫应答细胞，其中细胞在四种选项中可选iNKT，肿瘤抗原在近百种选项中可选GPC3，但靶向GPC3的CAR-iNKT这一具体组合并未经过实际验证(该申请并未验证任何一种免疫应答细胞的实际效果)。由于免疫系统中复杂的相互作用和肿瘤形成的不明机制，这样笼统的罗列并不能使得本领域技术人员得到任何靶向GPC3的CAR-iNKT可用的启示，更不能从中得出具体有效的靶向GPC3的CAR-iNKT及其制备方法和应用。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种GPC3靶向性的iNKT细胞及其制备方法，以及提供GPC3靶向性的iNKT细胞在治疗肿瘤制剂中的应用。为了解决上述问题，本专利技术所述的编码表达于人iNKT细胞表面的抗GPC3嵌合抗原受体蛋白核酸，其嵌合抗原受体蛋白包含按串联结构域连接的识别GPC3的C末端表位的单链抗体GPC3-ScFv、CD8的hinge区、跨膜区和CD28胞内信号区。优选的，所述GPC3嵌合抗原受体包括如SEQIDNO.1所示的核苷酸序列。更优的，所述GPC3嵌合抗原受体的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。本专利技术还公开了由所述抗GPC3嵌合抗原受体蛋白核酸编码的蛋白。本专利技术还公开了一种含有所述抗GPC3嵌合抗原受体蛋白核酸的表达载体，所述表达载体为重组质粒pRRL-GC33ScFv-CD8-CD28-4-1BB-CD3ζ。本专利技术还公开了所述抗GPC3嵌合抗原受体蛋白核酸用于制备iNKT细胞的用途。本专利技术还公开了一种iNKT细胞的制备方法，该方法包括以下步骤：采用Realtime-PCR从iNKT细胞的cDNA中克隆CD8跨膜区和hinge区，并通过RT-PCR从iNKT细胞cDNA中分别扩增CD8的hinge区和跨膜区，以及CD28和CD3ζ的胞内信号结构域，经酶切、胶回收后通过T4DNA连接酶连接到载体LT3REVIR(pRRL)，构建得到pRRL-CD8-CD28-4-1BB-CD3ζ；再通过全基因合成技术合成GPC3抗原受体(GC33本文档来自技高网...

【技术保护点】
编码表达于人iNKT细胞表面的抗GPC3嵌合抗原受体蛋白核酸，其嵌合抗原受体蛋白包含按串联结构域连接的识别GPC3的C末端表位的单链抗体GPC3‑ScFv、CD8的hinge区、跨膜区和CD28胞内信号区。

【技术特征摘要】
1.编码表达于人iNKT细胞表面的抗GPC3嵌合抗原受体蛋白核酸，其嵌合抗原受体蛋白包含按串联结构域连接的识别GPC3的C末端表位的单链抗体GPC3-ScFv、CD8的hinge区、跨膜区和CD28胞内信号区。2.权利要求1所述的抗GPC3嵌合抗原受体蛋白核酸，其特征是：所述GPC3嵌合抗原受体包括如SEQIDNO.1所示的核苷酸序列。3.权利要求1所述的抗GPC3嵌合抗原受体蛋白核酸，其特征是：所述GPC3嵌合抗原受体的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。4.由权利要求1-3任一项所述抗GPC3嵌合抗原受体蛋白核酸编码的蛋白。5.一种含有权利要求1-3任一项所述抗GPC3嵌合抗原受体蛋白核酸的表达载体，其特征在于，所述表达载体为重组质粒pRRL-GC33ScFv-CD8-CD28-4-1BB-CD3ζ。6.权利要求1-3任一项所述抗GPC3嵌合抗原受体蛋白核酸用于制备iNKT细胞的用途。7.一种iNKT细胞的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：采用Realtime-PCR从iNKT细胞的cDNA中克隆CD8跨膜区和hinge区，并通过RT-PCR从iNKT细胞cDNA中分别扩增CD8的hinge区和跨膜区，以及CD28和CD3ζ的胞内信号结构域，经酶切、胶回收后通过T4DNA连接酶连接到载体LT3REVIR(pRRL)，构建得到pRRL-CD8-CD28-4-1BB-CD3ζ；再通过全基因合成技术合成GPC3抗原受体(GC33)的核苷酸序列，经酶切、胶回收后克隆到pR...

【专利技术属性】
技术研发人员：闾军，陈辉，孙文峰，
申请(专利权)人：闾民，北京基因启明生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：河南,41