一种用于口蹄疫疫苗146S含量检测的标准抗原及其制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及一种用于口蹄疫疫苗146S含量检测的标准抗原制备方法，该方法使用二氯甲烷对口蹄疫病毒液进行抽提纯化，纯化效果能达到氯仿处理结果的水平，且与氯仿纯化试剂相比毒副作用更小，更易处理且对环境污染的风险性更低。

Standard antigen for detection of 146S content in foot and mouth disease vaccine and its preparation method and Application

The invention relates to a method for detection of FMD vaccine antigen standard 146S content preparation method, the method of foot-and-mouth disease virus by using dichloromethane extraction purification, purification effect can reach the level of chloroform treatment, and chloroform purification reagent more side effects than small, more manageable and the risk of environmental pollution lower.

【技术实现步骤摘要】
一种用于口蹄疫疫苗146S含量检测的标准抗原及其制备方法和应用
本专利技术涉及一种用于口蹄疫疫苗146S抗原含量检测的标准抗原、及其制备方法和应用，属于生物制品领域。
技术介绍
口蹄疫(Foot-and-MouthDisease，FMD)是由口蹄疫病毒引起的一种急性、热性、高度接触传染性的动物疫病，对各国的畜牧业有着巨大的危害。目前，口蹄疫的防控措施主要是以广泛的大面积免疫预防为主，配合以扑杀疫区内的病畜和易感动物并在周围10公里范围内进行环形预防注射。我国生产的口蹄疫疫苗基本上都是常规灭活疫苗，其制造工艺主要是用转瓶单层传代细胞培养法或悬浮培养法生产制苗用抗原，用二乙烯亚胺(BEI)对病毒进行灭活，利用油佐剂乳化配制疫苗。由于常规口蹄疫灭活疫苗生产中疫苗效力检验的关键作用，同时常规口蹄疫灭活疫苗作为当前控制口蹄疫疫病的主要武器，其安全有效的质量是防控口蹄疫的重要保障，因此如何更好的加强疫苗质量控制和相应的检测技术的研究直接关系到口蹄疫疫病防控的成功。146S病毒粒子是口蹄疫的主要免疫抗原，生产过程中这种病毒粒子的降解会导致疫苗免疫效力的下降。而传统的监测方法不能准确定量口蹄疫疫苗中146S的含量。近年来利用蔗糖密度梯度离心后定量口蹄疫病毒液中的146S含量作为检测口蹄疫抗原含量的方法正逐渐被业内专家接受并认可，但由于缺少一套稳定的标准抗原的制备和保存方法，同时使用常规的灭活口蹄疫疫苗形式保存的146S标准抗原当检测含量时必须破乳后再进行检测，而破乳环节会一定程度破坏口蹄疫抗原液中的抗原成分，造成检测不准确，导致不同机构和口蹄疫生产厂家的检测结果间往往差异较大。因此如何稳定地制备标准抗原和在不使用乳化剂的条件下实现标准抗原的稳定保存，以提高后续检测结果准确性，是急需解决的问题。专利申请CN102998378A公开了一种定量检测口蹄疫抗原146S的方法，该检测方法没有阳性对照，其存在批间检测无法矫正的缺点。专利申请CN104491855A公开了一种大规模制备口蹄疫全病毒颗粒疫苗的方法，其存在过程控制困难，批间重复不稳定的缺点，且其针对口蹄疫疫苗生产设计，只适用于大规模生产。因此，现实生产中缺少一种针对用于口蹄疫疫苗146S含量检测的标准抗原的、小规模的制备方法，其可以在制备口蹄疫全病毒颗粒疫苗中作为阳性对照使用，且其使得产品批间差异小，保证制备过程中抗原含量批间重复性，从而使得结果稳定。此外，在现有实验室纯化口蹄疫抗原过程，经常使用氯仿作为纯化试剂，其存在毒副作用大，存在对操作人员健康的不利影响和对操作安全设备的要求较高，且在后续处理时会污染环境，由于氯仿还属于公安部门的管制药品，生产企业采购、储藏、使用、管理都有极为严格的限制，经常会给抗原的制备带来不便。因此，需要提供一种使用替代的纯化试剂纯化口蹄疫抗原方法，以降低制备过程中试剂的毒性和腐蚀性，简化制备程序和保证操作安全。
技术实现思路
本专利技术涉及一种口蹄疫疫苗146S含量检测的标准抗原制备方法，所述方法在纯化过程中采用了二氯甲烷作为纯化试剂，纯化效果能达到氯仿处理结果的水平，且与氯仿纯化试剂相比毒副作用更小，更易处理且对环境污染的风险性更低。本专利技术涉及一种口蹄疫疫苗146S含量检测的标准抗原制备方法，其使用超滤管浓缩抗原，其抗原损失率大大降低且批间差最小最稳定，为制备定量口蹄疫标准抗原提供了有利的含量稳定性保障。本专利技术涉及口蹄疫疫苗146S含量检测的标准抗原制备方法，其使用的保护剂保证了口蹄疫抗原在常温不易降解，使得在后续使用中口蹄疫标准抗原无需处理可直接上样检测，减少了操作误差，保障了结果的稳定性。本专利技术制备146S检测用标准抗原。为146S灭活疫苗的检测提供阳性对照，可以矫正批间检测差异。1、本专利技术的专门针对检测用口蹄疫标准抗原的纯化方法，比生产制备方法平行性更好，生产的抗原更纯。2、本专利技术的抗原保护剂可在常温条件下有效保护抗原，抗原保存方法创新。标准抗原不含佐剂，检测146S标准抗原时不用破乳，所以不会带来抗原损失，检测结果与抗原含量真实值接近。附图说明图1为含有4％明胶保护剂的OXJ10-11F9株灭活抗原在4℃保存14天后HPLC测定146S抗原含量图；图2为含有15％甘油保护剂的OXJ10-11F9株灭活抗原在4℃保存14天后HPLC测定146S抗原含量图；图3为含有10％蔗糖保护剂的OXJ10-11F9株灭活抗原在4℃保存14天后HPLC测定146S抗原含量图；图4为含有本专利技术保护剂的OXJ10-11F9株灭活抗原在4℃保存14天后HPLC测定146S抗原含量图。具体实施方式以下，对本专利技术的实施方式进行说明。本专利技术涉及一种用于口蹄疫疫苗146S含量检测的标准抗原制备方法，所述方法包括以下步骤：步骤(1)使用传代细胞接种口蹄疫病毒，培养口蹄疫病毒；步骤(2)对所述培养口蹄疫病毒进行浓缩；步骤(3)使用二氯甲烷对所述步骤(2)中所述浓缩后的口蹄疫病毒液进行抽提纯化，二氯甲烷浓度为4％-6％，室温下搅拌后静置过夜，离心，收集上清液；步骤(4)对所述步骤(3)纯化后的口蹄疫病毒上清液进行灭活；以及步骤(5)对所述步骤(4)灭活的口蹄疫病毒液超滤离心，收获超滤离心后的口蹄疫病毒沉淀，使用缓冲液回溶得到所述口蹄疫疫苗146S标准抗原。由于氯仿具有较强毒性，在用于蛋白纯化时对操作安全设备要求较高，纯化后的废液需要进一步处理，且属于公安部门管制药品，本专利技术使用二氯甲烷替代氯仿进行蛋白纯化，降低了纯化过程对操作人员健康的不利影响和对操作安全设备的要求，当使用二氯甲烷用于口蹄疫抗原纯化，能够避免在纯化过程使用氯仿，毒性、挥发性、腐蚀性都低，因此对产品、设备、操作人员的损害都降低；还能保证生产中原料的正常供应，保障生产的持续进行。作为本专利技术的一种实施方式，本专利技术所述的标准抗原制备方法中，所述步骤(3)使用浓度为4％的二氯甲烷进行抽提纯化。本专利技术人发现，当使用4％的二氯甲烷代替2％的氯仿，纯化效果相当，其对杂蛋白的去除效率相近。作为本专利技术的一种实施方式，本专利技术所述的标准抗原制备方法中，所述步骤(1)中口蹄疫病毒包括牛O型ONXC/92株、牛Asia1/JSL/GSZY/06株、Mya98-XJ-2010株或猪O型0/ZK/93株；所述传代细胞包括BHK-21细胞；感染复数MOI为0.05，培养24-28h收获病毒液，所述收获病毒液经冻融处理，并离心除去细胞碎片。口蹄疫病毒ONXC/92株、Asial/JSL/GSZY/06株，0/Mya98/XJ/2010和0/GX/09-7毒株均购自中国农业科学院兰州兽医研究所。本专利技术所述的标准抗原制备方法，可以应用本领域的公知的生产用毒株进行制备，包括但不限于牛O型ONXC/92株、牛Asia1/JSL/GSZY/06株、Mya98-XJ-2010株或猪O型0/ZK/93株；制备所用的传代细胞可以使用本领域公知的传代细胞或原代细胞，包括但不限于BHK-21细胞。作为本专利技术的一种优选实施方式，本专利技术所述的标准抗原制备方法中，所述步骤(1)中所述收获病毒液经冻融处理，7000rpm离心，10℃连续离心60min除去细胞碎片。作为本专利技术的一种实施方式，本专利技术所述的标准抗原制备方法中，所述步骤(2)浓缩步骤用中空纤维超滤系本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于口蹄疫疫苗146S含量检测的标准抗原制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：步骤(1)使用传代细胞接种口蹄疫病毒，培养口蹄疫病毒；步骤(2)对所述培养口蹄疫病毒进行浓缩；步骤(3)使用二氯甲烷对所述步骤(2)中所述浓缩后的口蹄疫病毒液进行抽提纯化，二氯甲烷浓度为4％‑6％，室温下搅拌后静置过夜，离心，收集上清液；步骤(4)对所述步骤(3)纯化后的口蹄疫病毒上清液进行灭活；以及步骤(5)对所述步骤(4)灭活的口蹄疫病毒液超滤离心，收获超滤离心后的口蹄疫病毒沉淀，使用缓冲液回溶得到所述口蹄疫疫苗146S标准抗原。

【技术特征摘要】
1.一种用于口蹄疫疫苗146S含量检测的标准抗原制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：步骤(1)使用传代细胞接种口蹄疫病毒，培养口蹄疫病毒；步骤(2)对所述培养口蹄疫病毒进行浓缩；步骤(3)使用二氯甲烷对所述步骤(2)中所述浓缩后的口蹄疫病毒液进行抽提纯化，二氯甲烷浓度为4％-6％，室温下搅拌后静置过夜，离心，收集上清液；步骤(4)对所述步骤(3)纯化后的口蹄疫病毒上清液进行灭活；以及步骤(5)对所述步骤(4)灭活的口蹄疫病毒液超滤离心，收获超滤离心后的口蹄疫病毒沉淀，使用缓冲液回溶得到所述口蹄疫疫苗146S标准抗原。2.根据权利要求1所述的标准抗原制备方法，其特征在于，所述步骤(3)使用浓度为4％的二氯甲烷进行抽提纯化。3.根据权利要求1所述的标准抗原制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中口蹄疫病毒包括牛O型ONXC/92株、牛Asia1/JSL/GSZY/06株、Mya98-XJ-2010株或猪O型O/ZK/93株；所述传代细胞包括BHK-21细胞；感染复数MOI为0.05，培养24-28h收获病毒液，所述收获病毒液经冻融处理，并离心除去细胞碎片；优选地，7000rpm离心，10℃连续离心60min除去细胞碎片。4.根据权利要求1所述的标准抗原制备方法，其特征在于，所述步骤(2)的浓缩步骤用中空纤维超滤系统对所述步骤(1)中培养的口蹄疫病毒液进行超滤，中空纤维柱截留分子量为60kd-...

【专利技术属性】
技术研发人员：张涛，赵炳武，王永伟，孙聪，王咏梅，
申请(专利权)人：内蒙古必威安泰生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：内蒙古,15