一种去除口蹄疫抗原液中内毒素的方法技术

本发明专利技术涉及一种去除口蹄疫抗原液中内毒素的方法，采用强阴离子交换层析进行分离，包括如下步骤：(1)平衡：用平衡液对层析柱进行平衡；(2)调节：根据口蹄疫抗原液的内毒素含量计算上样体积，需满足上样总内毒素含量低于层析柱最大载量，取计算体积的所述抗原液调节电导率至18～22mS/cm后上样；(3)收集：所述抗原液上样后，当紫外吸收曲线上升时开始收集层析透过液，上样结束后继续用所述平衡液进柱，同时继续收集层析透过液，直至紫外吸收曲线降至趋于平缓；(4)再生：用再生液对层析柱进行再生。本发明专利技术方法操作简单、适于大规模生产应用，抗原回收率高，内毒素去除率高。内毒素去除率高。

【技术实现步骤摘要】
一种去除口蹄疫抗原液中内毒素的方法


[0001]本专利技术涉及兽药领域，具体涉及一种去除口蹄疫抗原液中内毒素的方法。

技术介绍

[0002]口蹄疫是猪、牛、羊等主要家畜和其它家养、野生偶蹄动物共患的一种急性、热性、高度接触性传染病，易感动物达70多种。临床特征是在口腔黏膜、蹄部和乳房皮肤发生水疱性疹。该病传播途径多、速度快，曾多次在世界范围内暴发流行，造成巨大政治、经济损失。鉴于此，世界动物卫生组织(OIE)将其列为A类传染病之首。目前，有三分之二的OIE成员国流行FMD，时刻威胁着无FMD国家和地区的家畜安全和畜产品贸易。
[0003]口蹄疫病毒属于微核糖核酸病毒科口蹄疫病毒属。其最大颗粒直径为23纳米，最小颗粒直径为7
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8纳米。口蹄疫病毒目前有O、A、C、SAT1、SAT2、SAT3(即南非1、2、3型)和Asia1(亚洲1型)7个血清型。各型之间几乎没有免疫保护力，感染了一型口蹄疫的动物仍可感染另一型口蹄疫病毒而发病。病毒外壳为对称的20面体。
[0004]目前口蹄疫疫苗采用最多的形式依然是完整病毒灭活疫苗，灭活疫苗是使用口蹄疫灭活抗原与油乳佐剂混合乳化而成的。其中口蹄疫灭活抗原由口蹄疫活病毒经灭活剂BEI(二乙烯亚胺)灭活而来，破坏病毒核酸使其丧失复制能力，但保留了完整的病毒外壳，即口蹄疫抗原。由于口蹄疫抗原完整颗粒的沉降系数为146S，因此一般也会将口蹄疫抗原代称作146S。
[0005]离子交换层析可以用于蛋白质的分离纯化。离子交换层析的基质是由带有电荷的树脂或纤维素组成。带有负电荷的称之阳离子交换树脂；而带有正电荷的称之阴离子树脂。由于蛋白质有等电点，当蛋白质处于不同的pH条件下，其带电状况也不同。阴离子交换基质结合带有负电荷的蛋白质，所以这类蛋白质被留在柱子上，然后通过提高洗脱液中的盐浓度等措施，将吸附在柱子上的蛋白质洗脱下来。结合较弱的蛋白质首先被洗脱下来。反之阳离子交换基质结合带有正电荷的蛋白质，结合的蛋白可以通过逐步增加洗脱液中的盐浓度或提高洗脱液的pH值洗脱下来。
[0006]本领域中有多种去除抗原液中内毒素的方法。
[0007]吸附过滤法的原理是利用含有活性炭的滤板或滤器对口蹄疫抗原液进行过滤，活性炭具有大量微孔，可吸附大多数有机物和部分无机物，其对内毒素也具有较强的吸附能力。这种方法操作简单，对其它杂蛋白也有一定程度的吸附去除。但是，活性炭的吸附力无选择性，对口蹄疫抗原也具有一定吸附性，因此吸附过滤法处理过程的抗原损失率较大，一般可达40％。
[0008]针对亲和层析法而言，对分离口蹄疫抗原与内毒素的亲和层析有两个方向，一是采用适合口蹄疫抗原吸附的特异性基团结合的层析介质，其可以特异性吸附口蹄疫抗原；二是采用适合吸附内毒素的特异性基团(如多粘菌素B)的层析介质，其可以特异性吸附内毒素。这种方法内毒素去除率高。但是，亲和层析介质制作困难，且口蹄疫病毒血清型毒株繁多，不同毒株不同培养方式产出抗原所对应的亲和介质均有差异，导致这种方法成本极
高，不适用于大规模生产应用。
[0009]凝胶过滤层析法的原理是利用凝胶的网状结构，根据分子大小进行分离的一种方法，口蹄疫抗原分子量明显高于内毒素，因此可经凝胶过滤使两者分离。但是，凝胶过滤层析法单次上样量极小，分离效率低、操作要求多。
[0010]对阴离子交换层析法而言，阴离子交换层析介质带有正电基团，能吸附带负电的粒子，在pH为7.8的溶液中内毒素和口蹄疫抗原均带负电，层析上样后阴离子交换层析介质会同时吸附抗原与内毒素，而抗原所带电强度弱于内毒素，因此在洗脱时采用梯度洗脱方式，先用低盐洗脱液使层析介质释放抗原，再用高盐洗脱液使层析介质释放内毒素，分段收集以达到分离目的。但是，这种传统的阴离子交换层析方式洗脱时盐浓度不易确定，收集洗脱液界限不好区分，极易导致抗原回收率低或内毒素去除率低两种状况出现其一。
[0011]液相分离法是将一定量的表面活性剂与口蹄疫抗原液充分搅拌混合，从抗原液中萃取内毒素，再通过高速离心分离。但是，这种方法需高速离心，如使用台式离心机则操作繁复、占用人员较多，采用连续流离心机则成本过高，而且表面活性剂会有部分残留于分离后的抗原液中，这种新引入的杂质对后续配制的口蹄疫灭活疫苗可能会有动物免疫应激等方面的负面影响。
[0012]超滤洗滤法是利用口蹄疫抗原与内毒素大小的差异，选择孔径介于两者之间的超滤膜系统对它们进行分离，具体操作法与常规超滤浓缩技术相同。但是，洗滤过程中不断加入缓冲液，以达到对抗原液进一步漂洗纯化的目的，这会导致抗原一定程度的降解，洗滤过程的抗原损失率一般能达20％以上，而且由于孔径限制，这种方法对内毒素的去除具有一定界限，内毒素去除率一般最高为75％。
[0013]因此，有必要提供一种去除口蹄疫灭活抗原液中内毒素的新方法，以克服上述各方法的缺陷。

技术实现思路

[0014]有鉴于此，本专利技术提供一种去除口蹄疫灭活抗原液中内毒素的方法，操作简单、成本较低，适于大规模生产应用，抗原回收率高，内毒素去除率高，无杂质引入，抗原在处理过程中不易降解。
[0015]根据本专利技术，一种去除口蹄疫抗原液中内毒素的方法，采用强阴离子交换层析进行分离，包括如下步骤：(1)平衡：用平衡液对层析柱进行平衡；(2)调节：根据口蹄疫抗原液的内毒素含量计算上样体积，需满足上样总内毒素含量低于层析柱最大载量，取计算体积的抗原液调节电导率至18～22mS/cm后上样；(3)收集：抗原液上样后，当紫外吸收曲线上升时开始收集层析透过液，上样结束后继续用平衡液进柱，同时继续收集透过液，直至紫外吸收曲线降至趋于平缓；(4)再生：用再生液对层析柱进行再生。
[0016]本专利技术采用的层析介质是以季铵类物质为主要基团的强阴离子交换介质，对带负电物质具有较强的吸附能力，而且其对离子强度不同的物质的吸附能力也存在差异，如对蛋白、盐离子及内毒素的吸附能力就有强弱差别。本专利技术正是利用了强阴离子交换介质对这三种物质的吸附能力差异来进行有效分离，本专利技术人通过长期的探索，通过调节抗原液
电导率(即离子强度)使上样过程中的离子交换介质处于只对内毒素具有强吸附力的状态，而对抗原吸附力较弱，抗原可以完全透过。
[0017]本专利技术中平衡液pH为7.8～8.0，电导率为18～22mS/cm；优选为含150～200mmol/L NaCl的20mmol/L浓度PB溶液，其pH为7.8～8.0，电导率为18～22mS/cm。本专利技术中平衡液可用其它pH为7.8～8.0，电导率为18～22mS/cm的缓冲液替换，要求其不与口蹄疫抗原反应、不破坏层析介质。
[0018]本专利技术的抗原液pH值调节为7.8～8.0；本专利技术的抗原液电导率优选调节至18mS/cm。
[0019]本专利技术中处理的口蹄疫抗原液的抗原纯度(抗原含量/总蛋白含量)为50～95％，特别地该抗原由必威安泰生物科技公司纯化工艺生产。
[0020]本专利技术抗原液上样的流速为200～380cm/h，优选本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种去除口蹄疫抗原液中内毒素的方法，采用强阴离子交换层析进行分离，包括如下步骤：(1)平衡：用平衡液对层析柱进行平衡；(2)调节：根据口蹄疫抗原液的内毒素含量计算上样体积，需满足上样总内毒素含量低于层析柱最大载量，取计算体积的所述抗原液，调节其电导率至18～22mS/cm后上样；(3)收集：所述抗原液上样后，当紫外吸收曲线上升时开始收集层析透过液，上样结束后继续用所述平衡液进柱，同时继续收集层析透过液，直至紫外吸收曲线降至趋于平缓；(4)再生：用再生液对所述层析柱进行再生。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述平衡液的pH为7.8～8.0，电导率为18～22mS/cm；所述平衡液优选为含150～200mmol/L NaCl的20mmol/L浓度PB溶液，其pH为7.8～8.0，电导率为18～22mS/cm。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所...

【专利技术属性】
技术研发人员：梁亮，刘延麟，李成龙，田普厚，莫日根，包其木勒格，周荣伟，王小波，刘月，张涛，刘冬冬，王国华，潘相臣，刘洪明，周灵芝，王颖，张七斤，
申请(专利权)人：内蒙古必威安泰生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：