一种口蹄疫病毒竞争ELISA检测试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及一种口蹄疫病毒抗体的竞争ELISA检测试剂盒，该试剂盒包括：单域抗体sdAb‑A；A/AKT‑Ⅲ株FMDV灭活抗原；单克隆抗体9C10，封闭液；金标二抗；和支持介质。通过将口蹄疫抗原与包被在支持介质上的特异性单域抗体结合，单克隆抗体9C10和待检血清中的抗体与抗原竞争性结合，通过金标的马抗小鼠IgG检测，在检测样品时只需要加入待检样品与单抗9C10孵育1h，即可加入金标二抗进行10min的显色，洗涤后即可度值，操作简单、诊断快速。本发明专利技术的竞争ELISA检测试剂盒检测灵敏度高，与病毒中和反应的符合率较其他商业检测试剂盒更高。

A competitive ELISA kit for detection of foot-and-mouth disease virus

The present invention relates to a competitive ELISA detection kit for foot and mouth disease virus antibodies, which includes: single domain antibody sdAb_A; inactivated FMDV antigen of A/AKT_III strain; monoclonal antibody 9C10, blocking solution; gold label II antibody; and support medium. By combining foot-and-mouth disease antigen with specific monoclonal antibody coated on supporting medium, monoclonal antibody 9C10 and antibody in serum to be tested competently bind to antigen, and by detecting IgG of horse anti-mice in gold standard, only one hour incubation with monoclonal antibody 9C10 is needed to detect the sample, and then the second antibody of gold standard can be added for 10 minutes of color rendering. After washing, the degree value can be obtained, and the operation is simple. Rapid diagnosis. The competitive ELISA detection kit of the invention has high detection sensitivity and higher coincidence with virus neutralization reaction than other commercial detection kits.

【技术实现步骤摘要】
一种口蹄疫病毒竞争ELISA检测试剂盒
本专利技术属于免疫测定法和相应的生物物质领域，具体涉及一种口蹄疫病毒抗体的检测方法及应用。
技术介绍
口蹄疫(foot-and-mouthdisease，FMD)是由口蹄疫病毒(foot-and-mouthdiseasevirus，FMDV)引起的一种感染偶蹄目动物的急性、热性、接触传染性动物疫病。FMD是国际兽医局规定的必报传染病，也被中国认定为一类传染病。口蹄疫致死率很低，但病毒可以在体内长期存活，患畜持续排毒，成为重要的传染源，会给畜牧业生产和进出口贸易造成巨大的经济损失，该病不仅严重影响畜牧业的发展，也对人类健康构成很大威胁。因此，开发研究更便捷、快速、敏感、快速诊断试剂盒变得尤为重要。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种口蹄疫病毒抗体的竞争ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：单域抗体sdAb-A，所述单域抗体sdAb-A序列如SEQIDNO.1所示；A/AKT-Ⅲ株FMDV灭活抗原；单克隆抗体9C10，所述单克隆抗体9C10由分泌口蹄疫A型单克隆抗体杂交瘤细胞9C10株分泌，所述杂交瘤细胞9C10株保藏编号为CGMCCNo.17081；封闭液；金标二抗；支持介质。本专利技术通过特定的单域抗体sdAb-A和单克隆抗体9C10使得检测的灵敏度高，与病毒中和反应的符合率较其他商业检测试剂盒更高。本专利技术以口蹄疫的A型单域抗体作为包被抗体，建立一种检测口蹄疫病毒抗体的竞争ELISA检测试剂盒。由于二抗一般为多抗，因此一个一抗分子上可以结合多个二抗分子，同时一个二抗分子上可以标记多个金颗粒，所有当待检抗体为多抗时，信号经过放大，最终提高了检测的灵敏度。另外由于二抗制备比较容易，所有无需将一抗进行标记，大大缩减了工作量。为该病检验检疫提供有效实用的检测方法。A/AKT-Ⅲ株FMDV株可商业上获得，例如可自新疆维吾尔自治区畜牧科学院兽医研究所商购。作为本专利技术的一种实施方式，本专利技术的试剂盒中，A/AKT-Ⅲ株FMDV抗原包被浓度为1.5ug/ml，所述单域抗体sdAb-A浓度为1.5ug/ml。作为本专利技术的一种实施方式，本专利技术的试剂盒中，所述封闭液为5％脱脂乳。作为本专利技术的一种实施方式，本专利技术的试剂盒中，所述单克隆抗体浓度为0.375ug/ml。作为本专利技术的一种实施方式，本专利技术的试剂盒中，所述金标二抗为金标马抗鼠多抗，金标抗体抗体浓度为0.025ug/ml。作为本专利技术的一种实施方式，本专利技术的试剂盒中，所述支持介质为酶标板。本专利技术还提供了所述口蹄疫病毒抗体的竞争ELISA检测试剂盒在非诊断目的的检测A型口蹄疫中的应用。口蹄疫病毒抗体竞争ELISA检测，具有快速、简便、准确、稳定等特点，可用于口蹄疫的快速、批量抗体检测。本专利技术还提供了所述口蹄疫病毒抗体的竞争ELISA检测试剂盒的检测方法，通过将口蹄疫A/AKT-Ⅲ株FMDV灭活抗原与包被在支持介质上的单域抗体sdAb-A结合，单克隆抗体9C10和待检血清中的抗体与抗原竞争性结合，通过金标的马抗小鼠IgG进行检测。优选地，所述A/AKT-Ⅲ株FMDV灭活抗原包被浓度为1.5ug/ml，所述单域抗体sdAb-A浓度为1.5ug/ml。优选地，所述抗原作用时间1h。优选地，在所述支持介质上包被单域抗体sdAb-A后进行封闭，所述封闭液为5％脱脂乳。优选地，所述封闭液封闭时间为37℃1h。优选地，所述单克隆抗体浓度为0.375ug/ml。优选地，所述单克隆抗体作用条件、时间为37℃孵育1h。优选地，所述金标二抗为金标马抗鼠多抗，金标抗体抗体浓度为0.025ug/ml。优选地，所述金标二抗作用时间为10min。优选地，所述支持介质为酶标板。具体实施方式以下，对本专利技术的实施方式进行说明。实施例1单抗的制备1.1口蹄疫抗原(A/AKT-Ⅲ株FMDV灭活抗原)为实验室保存。1.2免疫脾细胞的制备取纯化好的抗原与等体积的佐剂充分混匀，注入小鼠体内，每只每次注射剂量为1ml，经过一免、二免、三免和增强免后，测小鼠血清中抗体滴度，将显示有足够抗体滴度(1:108)(ELISA效价)的小鼠作为免疫脾细胞的来源。测定抗体滴度的方法为ELISA检测方法。1.3骨髓瘤细胞的制备骨髓瘤细胞SP2/0细胞为实验室所保存。1.4细胞融合1.4.1细胞融合将1.2中足够抗体滴度的小鼠进行脾脏分离，并制备脾淋巴细胞悬液。通过细胞计数，使脾淋巴细胞与SP2/0骨髓瘤细胞以1：10的数量比进行混合，以800r/min离心5min后尽可能的弃净上清，向50mL离心管沉淀中缓慢加入37℃预温的促融剂(PEG1450)进行融合，融合后，800r/min离心5min后弃上清，向离心管中加入50mL选择培养基HAT(15％胎牛血清，1％HAT，1％双抗，1％谷氨酰胺)将融合后的细胞轻轻的重悬混匀后，铺入事先制备好的生长饲养层细胞的96孔细胞培养板内，每孔100μL，放入37℃，5％二氧化碳的细胞培养箱中培养。每隔三天用选择培养液HAT进行半换液，直到孔内细胞克隆长至底面积1/4～1/3时，更换新的培养液培养2～3天后，取培养上清进行检测。1.4.2饲养层细胞的制备：1.4.2.1准备：在进行细胞融合前2天，挑选健康BALB/c小鼠，放入单独的鼠笼中饥饿4h。选择培养液HAT(32mL，每板10mL，3块板/只鼠)37℃预热30min。鼠架、剪刀、镊子紫外照射消毒30min。1.4.2.2暴露腹膜：饥饿4h后的BALB/c小鼠被脱颈处死后，用75％酒精浸泡5min，对小鼠体表进行消毒。将小鼠固定在鼠架上，用镊子和剪刀将小鼠的皮肤和腹膜分离，腹膜完全暴露。1.4.2.3腹腔内细胞采集：将预热的32mL选择培养液HAT放入灭菌的平皿中，10mL注射器中吸入8mL培养液，用镊子夹起腹膜，针头刺入腹膜，镊子夹住针头，伸入腹腔，注射器缓慢的抽吸数次，待注射器中的液体呈微黄色后，注射器针头退出腹腔，摘下针头后将液体缓慢注入平皿中。处理小鼠，消毒操作台。1.4.2.4铺板：取3块96孔细胞培养板，用8道移液器将1.4.2.3制备的细胞悬液加入细胞培养板中，100μL/孔。1.4.3SP2/0骨髓瘤细胞的制备：1.4.3.1融合前36～48h，将SP2/0细胞扩大培养，使细胞处于对数生长期。1.4.3.2融合当天，选取浑圆透亮、大小均一、排列整齐的细胞。用DMEM基础培养液将细胞从瓶壁上吹下，置于50mL无菌离心管内，800r/min离心10min。用DMEM基础培养液将细胞沉淀重悬，混匀。取少量骨髓瘤细胞悬液，进行台盼兰染色计数，备用等待下一步细胞融合实验。1.4.4免疫BALB/c小鼠脾细胞的制备：1.4.4.1融合前，用弯头镊子摘除经加强免疫后3天的BALB/c小鼠眼球，收集血液经低速离心分离血清，该血清即为间接ELISA中的阳性对照。将小鼠颈部脱臼致死，并浸泡于75％酒精中对小鼠体表进行灭菌，5min后放于超净台内，将小鼠夹在鼠架上。1.4.4.2无菌打开腹腔，取出脾脏去除结缔组织，将脾脏放入装有灭菌尼龙网和盛有15mLDMEM基础培养液的平皿中，用尖头镊子夹起脾脏，10mL注射器换上1mL注射器的针头吸取10mLDMEM基础培养液，针头经镊子中间刺入脾脏，缓慢的将培本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种口蹄疫病毒抗体的竞争ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：单域抗体sdAb‑A，所述单域抗体sdAb‑A序列如SEQ ID NO.1所示；A/AKT‑Ⅲ株FMDV灭活抗原；单克隆抗体9C10，所述单克隆抗体9C10由分泌口蹄疫A型单克隆抗体杂交瘤细胞9C10株分泌，所述杂交瘤细胞9C10株保藏编号为CGMCC No.17081；封闭液；金标二抗；支持介质。

【技术特征摘要】
1.一种口蹄疫病毒抗体的竞争ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：单域抗体sdAb-A，所述单域抗体sdAb-A序列如SEQIDNO.1所示；A/AKT-Ⅲ株FMDV灭活抗原；单克隆抗体9C10，所述单克隆抗体9C10由分泌口蹄疫A型单克隆抗体杂交瘤细胞9C10株分泌，所述杂交瘤细胞9C10株保藏编号为CGMCCNo.17081；封闭液；金标二抗；支持介质。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，A/AKT-Ⅲ株FMDV抗原包被浓度为1.5ug/ml，所述单...

【专利技术属性】
技术研发人员：张涛，徐娜，刘月，何召庆，刘金萍，张晓慧，徐婉英，张春辉，孙聪，
申请(专利权)人：内蒙古必威安泰生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：内蒙古,15