一种检测鸡白细胞介素12含量的方法及其专用试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种检测鸡白细胞介素12含量的方法及其专用试剂盒。本发明专利技术利用chIL‑12单克隆抗体建立了针对chIL‑12在蛋白水平上的双夹心ELISA检测方法。通过实验证明：本发明专利技术的抗chIL‑12单克隆抗体具有良好的特异性和亲和力，能够准确地反映出血清或细胞上清中chIL‑12的含量，且本发明专利技术的检测方法快捷、高效又准确，解决了现有技术中采用荧光定量PCR检测方法带来的操作繁琐，耗时耗力，易受操作及其他外部条件影响等问题，不仅有助于评价chIL‑12在机体内的动态变化水平，为疾病的预防和治理提供很好的参考，而且有助于了解鸡类传染性疾病的发生、发展、转归情况及机体保护性免疫反应的动态。

A Method for Detecting Chicken Interleukin 12 Content and Its Special Kit

The invention discloses a method for detecting Chicken Interleukin 12 content and a special kit thereof. The invention establishes a double sandwich ELISA detection method for chIL 12 at protein level by using chIL 12 monoclonal antibody. Experiments show that the anti-chIL 12 monoclonal antibody of the invention has good specificity and affinity, can accurately reflect the content of chIL 12 in serum or cell supernatant, and the detection method of the invention is fast, efficient and accurate, which solves the complicated operation, time-consuming and labor-consuming, and is easy to be operated and other external strips brought about by the fluorescence quantitative PCR detection method in the prior art. These problems not only help to evaluate the dynamic changes of chIL 12 in vivo, provide a good reference for disease prevention and treatment, but also help to understand the occurrence, development, prognosis of chicken infectious diseases and the dynamics of protective immune response.

【技术实现步骤摘要】
一种检测鸡白细胞介素12含量的方法及其专用试剂盒
本专利技术属于生物
，具体涉及一种检测鸡白细胞介素12(chIL-12)含量的方法及其专用试剂盒。
技术介绍
白细胞介素12(Interleukin-12，IL-12)是B细胞、巨噬细胞以及中性粒细胞等在受到各种刺激时释放的一种细胞因子。IL-12是目前所发现的细胞因子中对体内免疫活性细胞诱导和调节作用最强、范围最广的一种细胞因子。IL-12有多种生物学功能，在肿瘤、病毒性疾病及寄生虫病的免疫治疗中发挥重要的作用。单克隆抗体技术是利用在体外培养能大量无限增殖但不能分泌特异性抗体的骨髓瘤细胞和能产生特异性抗体但在体外不能无限增殖的B淋巴细胞进行细胞融合，获得既能够无限增值又能够分泌抗体的杂交瘤细胞。只有融合的杂交瘤细胞能够在选择培养基中存活和增殖，又经过三次亚克隆及间接ELISA方法的筛选，最终获得能分泌特异性识别单一抗原表位抗体的杂交瘤细胞，经小鼠腹腔内培养，即可无限制地大量获得单克隆抗体。夹心ELISA是利用纯化的抗体包被酶标板，洗涤后加入待检测的抗原，洗涤后加入酶标抗体进行反应，最后加入底物显色的一种酶联免疫吸附试验，该方法可用于抗原的检测。目前已有人和小鼠IL-12细胞因子的检测试剂盒，能够从蛋白水平反映出机体的感染或免疫状态。但由于鸡IL-12基因序列与哺乳动物的同源性较低，因此不能将其检测试剂盒直接用于鸡血清中IL-12的检测。而目前在国内外尚未出现鸡IL-12细胞因子商品化检测试剂盒。科学研究领域仅能够通过使用荧光定量PCR的方法检测鸡细胞因子的mRNA水平。但由于在mRNA翻译蛋白质的过程中，细胞内仍有许多的调控，并不能够直接真实地反映出鸡体内chIL-12的蛋白水平。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的是提供抗chIL-12的单克隆抗体。本专利技术提供的抗chIL-12的单克隆抗体结合chIL-12氨基酸序列的第1-98位或第99-197位。所述chIL-12氨基酸序列如序列表中序列2所示。进一步的，所述单克隆抗体是由保藏号为CGMCCNo.15893的杂交瘤细胞株LHK-1分泌的或由保藏号为CGMCCNo.15894的杂交瘤细胞株LHK-2分泌的。所述保藏号为CGMCCNo.15893的杂交瘤细胞株LHK-1分泌的抗chIL-12的单克隆抗体结合chIL-12氨基酸序列的第1-98位；所述保藏号为CGMCCNo.15894的杂交瘤细胞株LHK-2分泌的抗chIL-12的单克隆抗体结合chIL-12氨基酸序列的第99-197位。将由保藏号为CGMCCNo.15893的杂交瘤细胞株LHK-1分泌的抗chIL-12的单克隆抗体命名为LHK-1抗体；将由保藏号为CGMCCNo.15894的杂交瘤细胞株LHK-2分泌的抗chIL-12的单克隆抗体命名为LHK-2抗体。本专利技术的第二个目的是提供一株分泌抗chIL-12的单克隆抗体的杂交瘤细胞株LHK-1。本专利技术提供的分泌抗chIL-12的单克隆抗体的杂交瘤细胞株LHK-1的保藏号为CGMCCNo.15893。所述杂交瘤细胞株LHK-1的分类命名为杂交瘤细胞株，该杂交瘤细胞株已于2018年6月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)。本专利技术的第三个目的是提供一株分泌抗chIL-12的单克隆抗体的杂交瘤细胞株LHK-2。本专利技术提供的分泌抗chIL-12的单克隆抗体的杂交瘤细胞株LHK-2的保藏号为CGMCCNo.15894。所述杂交瘤细胞株LHK-2的分类命名为杂交瘤细胞株，该杂交瘤细胞株已于2018年6月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)。本专利技术的第四个目的是提供一种检测或辅助检测待测样品中chIL-12含量的酶联免疫试剂盒。本专利技术提供的检测或辅助检测待测样品中chIL-12含量的酶联免疫试剂盒包括LHK-1抗体和/或LHK-2抗体。上述酶联免疫试剂盒还包括chIL-12标准品；所述chIL-12标准品是通过将核苷酸序列如序列表中序列1所示的chIL-12基因在原核细胞中进行表达获得的。所述酶联免疫试剂盒中还包括如下中的至少一种：酶标板、包被缓冲液、洗涤缓冲液、抗体稀释液、封闭液、辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素(HRP标记的链霉亲和素)、显色液和终止液。本专利技术的第五个目的是提供上述单克隆抗体或上述杂交瘤细胞株或上述酶联免疫试剂盒的新用途。本专利技术提供了上述单克隆抗体或上述杂交瘤细胞株或上述酶联免疫试剂盒在检测或辅助检测待测样品中chIL-12含量中的应用。本专利技术还提供了上述单克隆抗体或上述杂交瘤细胞株或上述酶联免疫试剂盒在制备检测或辅助检测待测样品中chIL-12含量的产品中的应用。所述产品可为试剂或胶体金试纸条或试剂盒。本专利技术的第六个目的是提供一种检测或辅助检测待测样品中chIL-12含量的方法。本专利技术提供的检测或辅助检测待测样品中chIL-12含量的方法是以LHK-2抗体为检测抗体、LHK-1抗体为包被抗体的双抗体夹心ELISA检测方法。上述检测或辅助检测待测样品中chIL-12含量的方法可包括如下步骤：(1)将LHK-1抗体包被到酶标板上，洗涤；(2)封闭(1)得到的酶标板，洗涤；(3)向(2)得到的酶标板中加入chIL-12标准品或待测样品，孵育，洗涤；(4)向(3)得到的酶标板中加入生物素化的LHK-2抗体，孵育，洗涤；(5)向(4)得到的酶标板中加入HRP标记的链霉亲和素，孵育，洗涤；(6)向(5)得到的酶标板中加入底物显色，显色后加入终止液终止反应；(7)用酶标仪检测加入chIL-12标准品的各孔的吸光度值，以chIL-12标准品浓度为横坐标、以酶标仪的读数为纵坐标绘制标准曲线；(8)用酶标仪检测加入待测样品的孔的吸光度值，将所述吸光度值代入所述标准曲线，即得待测样品中chIL-12的浓度。进一步的，所述步骤(1)中，用磷酸盐缓冲液将LHK-1抗体稀释后包被到酶标板上。所述步骤(2)中，用脱脂奶溶液封闭(1)得到的酶标板。所述步骤(3)中，用BSA溶液将chIL-12标准品稀释后加入酶标板中。所述步骤(4)中，用BSA溶液将生物素化的LHK-2抗体稀释后加入酶标板中。更进一步的，所述步骤(1)中，所述抗体的浓度稀释至5μg/mL；所述包被的条件为4℃包被12h；所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.05M，pH为6.0；所述步骤(2)中，所述脱脂奶溶液的质量分数为5％；所述封闭的条件为37℃封闭2h；所述步骤(3)和步骤(4)中，所述BSA溶液的质量分数为1％；所述步骤(3)中，所述孵育时间为1h；所述步骤(4)中，所述抗体的浓度稀释至1μg/mL；所述孵育时间为1h；所述步骤(5)中，所述孵育时间为30min；所述用酶标仪检测吸光度值时的波长为450nm；所述洗涤的次数为6次。所述底物为TMB；所述终止液为2MH2SO4。本专利技术在酶联免疫的基础上结合生物素-链霉亲和素系统建立了双抗体夹心ELISA检测方法，该方法利用标记了抗体的生物素和HRP标记的链霉亲和素之间的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.抗chIL‑12的单克隆抗体，其结合chIL‑12氨基酸序列的第1‑98位或第99‑197位；所述chIL‑12氨基酸序列如序列表中序列2所示。

【技术特征摘要】
1.抗chIL-12的单克隆抗体，其结合chIL-12氨基酸序列的第1-98位或第99-197位；所述chIL-12氨基酸序列如序列表中序列2所示。2.抗chIL-12的单克隆抗体，是由保藏号为CGMCCNo.15893的杂交瘤细胞株LHK-1分泌的或由保藏号为CGMCCNo.15894的杂交瘤细胞株LHK-2分泌的。3.一株分泌抗chIL-12的单克隆抗体的杂交瘤细胞株LHK-1，其保藏号为CGMCCNo.15893。4.一株分泌抗chIL-12的单克隆抗体的杂交瘤细胞株LHK-2，其保藏号为CGMCCNo.15894。5.一种检测或辅助检测待测样品中chIL-12含量的酶联免疫试剂盒，其包括权利要求1或2所述的单克隆抗体和/或权利要求3或4所述的杂交瘤细胞株。6.权利要求1或2所述的单克隆抗体或权利要求3或4所述的杂交瘤细胞株或权利要求5所述的酶联免疫试剂盒在检测或辅助检测待测样品中chIL-12含量中的应用；或，权利要求1或2所述的单克隆抗体或权利要求3或4所述的杂交瘤细胞株在制备检测或辅助检测待测样品中chIL-12含量的产品中的应用。7.一种检测或辅助检测待测样品中chIL-12含量的方法，是以权利要求1所述的单克隆抗体为检测抗体、权利要求2所述的单克隆抗体为包被抗体的双抗体夹心ELISA检测方法。8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：(1)将权利要求2所述的单克隆抗体包被到酶标板上，洗涤；(2)封闭(1)得到的酶标板，洗涤；(3)向(2)得到的酶标板中加入chIL-12标准品或待测样品，孵育，洗涤；(4)向(3)得到的酶...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑世军，刘海坤，王永强，李晓齐，曹红，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：北京,11