AKT-Ⅲ株口蹄疫抗原夹心ELISA检测试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及一种A/AKT‑Ⅲ株口蹄疫病毒抗原的夹心ELISA检测试剂盒，该试剂盒包括：单域抗体sdAb‑A；单克隆抗体9C10，封闭液；金标二抗；和支持介质。通过将特异性单域抗体包被在支持介质上，与待检抗原和单克隆抗体9C10形成夹心组合，通过金标的马抗小鼠IgG检测，在检测样品时只需要加入待检样品与单抗9C10孵育1h，即可加入金标二抗进行10min的显色，洗涤后即可度值，操作简单、诊断快速。本发明专利技术的竞争ELISA检测试剂盒检测灵敏度高，所用的抗体特异性非常高，可用于口蹄疫不同血清型间的分型，也可以区分A型不同毒株，且146S检测结果与传统蔗糖密度梯度离心法测定146S结果相符，而检测速度与检测样品数量更快更多。

【技术实现步骤摘要】
AKT-Ⅲ株口蹄疫抗原夹心ELISA检测试剂盒
本专利技术属于免疫测定法和相应的生物物质领域，具体涉及一种口蹄疫病毒抗原的检测方法及应用。
技术介绍
口蹄疫(foot-and-mouthdisease，FMD)是由口蹄疫病毒(foot-and-mouthdiseasevirus，FMDV)引起的一种感染偶蹄目动物的急性、热性、接触传染性动物疫病。FMD是国际兽医局规定的必报传染病，也被中国认定为一类传染病。口蹄疫致死率很低，但病毒可以在体内长期存活，患畜持续排毒，成为重要的传染源，会给畜牧业生产和进出口贸易造成巨大的经济损失，该病不仅严重影响畜牧业的发展，也对人类健康构成很大威胁。目前，口蹄疫的防控措施主要是以广泛的大面积免疫预防为主，配合以扑杀疫区内的病畜和易感动物,并在周围10公里范围内进行环形预防注射。疫苗接种是特异性预防FMD的有效手段，制备安全有效的疫苗是成功地预防、控制乃至最终消灭FMD的先决条件。FMD灭活疫苗具有良好的免疫原性，在预防和控制FMD的过程中发挥着重要作用，FMD疫苗有效抗原含量是评价该疫苗的重要标准，在生产过程中快速高通量的测定FMD疫苗中有效抗原含量，对生产工作起着尤为关键的技术支持作用。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种A/AKT-Ⅲ株口蹄疫病毒抗原的夹心ELISA检测试剂盒，所述试剂盒包括：单域抗体sdAb-A，所述单域抗体sdAb-A序列如SEQIDNO.1所示；单克隆抗体9C10，所述单克隆抗体9C10由分泌口蹄疫A型单克隆抗体杂交瘤细胞9C10株分泌，所述杂交瘤细胞9C10株保藏编号为CGMCCNo.17081；封闭液；金标二抗；以及包被所述单域抗体sdAb-A的支持介质。本专利技术通过特定的单域抗体sdAb-A和单克隆抗体9C10使得检测的灵敏度高，本试剂盒所用的抗体特异性非常高，完全可用于口蹄疫不同血清型间的分型，即可将A型与O型和亚洲1型区分开，也可以区分A型不同毒株，即可将A/AKT-Ⅲ株与A型的其他毒株区分开,且146S检测结果与传统蔗糖密度梯度离心法测定146S结果相符，而检测速度与检测样品数量更快更多。本专利技术以口蹄疫的A型单域抗体作为包被抗体，建立一种检测AKT-Ⅲ株口蹄疫病毒抗原的夹心ELISA检测试剂盒。由于二抗一般为多抗，因此一个一抗分子上可以结合多个二抗分子，同时一个二抗分子上可以标记多个金颗粒，所有当待检抗体为多抗时，信号经过放大，最终提高了检测的灵敏度。另外由于二抗制备比较容易，所有无需将一抗进行标记，大大缩减了工作量。为该病检验检疫提供有效实用的检测方法。A/AKT-Ⅲ株FMDV株可商业上获得，例如可购自新疆维吾尔自治区畜牧科学院兽医研究所商购。作为本专利技术的一种实施方式，本专利技术的试剂盒中，单域抗体sdAb-A包被浓度为1.3μg/mL。作为本专利技术的一种实施方式，本专利技术的试剂盒中，所述封闭液为5％脱脂乳。作为本专利技术的一种实施方式，本专利技术的试剂盒中，所述A/AKT-Ⅲ株FMDV单克隆抗体9C10检测浓度为1.5μg/mL。作为本专利技术的一种实施方式，本专利技术的试剂盒中，所述金标二抗为金标马抗鼠多抗，所述金标二体浓度为0.025μg/mL。作为本专利技术的一种实施方式，本专利技术的试剂盒中，所述支持介质为酶标板。作为本专利技术的一种实施方式，本专利技术的试剂盒中，所述试剂盒还包括阴阳性对照及已确定146S含量的灭活的A/AKT-Ⅲ株FMDV抗原标准品，所述阴性对照为FMDV病毒接种前细胞培养基，所述阳性对照为灭活的A/AKT-Ⅲ株FMDV抗原。本专利技术还提供了所述A/AKT-Ⅲ株口蹄疫病毒抗原的夹心ELISA检测试剂盒在非诊断目的的检测A/AKT-Ⅲ株抗原及含量中的应用。A/AKT-Ⅲ株口蹄疫病毒抗原的夹心ELISA检测，具有快速、简便、准确、稳定等特点，可用于口蹄疫的快速、批量抗原检测。本专利技术还提供了所述A/AKT-Ⅲ株口蹄疫病毒抗原的夹心ELISA检测试剂盒的检测方法，通过将单域抗体sdAb-A包被在支持介质上，待检抗原，单克隆抗体9C10形成夹心，通过金标的马抗小鼠IgG进行检测。本专利技术还涉及一种所述A/AKT-Ⅲ株口蹄疫病毒抗原的夹心ELISA检测试剂盒的检测方法，其中，所述方法包括：步骤(1)用所述单域抗体sdAb-A包被酶标板；步骤(2)用所述封闭液封闭所述步骤(1)包被的酶标板；步骤(3)将待检抗原样品加入到所述步骤(2)封闭的酶标板，孵育，洗涤；步骤(4)将所述单克隆抗体9C10加入到所述步骤(3)的所述酶标板，孵育，洗涤；步骤(5)将所述金标二抗加入到所述步骤(4)的所述酶标板，孵育，洗涤；以及步骤(6)酶标仪在波长540nm处读数，判断阴阳性。优选地，所述单域抗体sdAb-A包被浓度为1.3μg/mL。优选地，所述单域抗体sdAb-A包被条件为4℃包被过夜。优选地，在所述支持介质上包被单域抗体sdAb-A后进行封闭，所述封闭液为5％脱脂乳。优选地，所述封闭液封闭时间为37℃1h。优选地，所述待检抗原样品作用时间40min。优选地，所述单克隆抗体9C10浓度为1.5μg/mL。优选地，所述单克隆抗体9C10作用条件、时间为37℃孵育30min。优选地，所述金标二抗为金标马抗鼠多抗，金标二抗浓度为0.025μg/mL。优选地，所述金标二抗作用时间为室温10min。优选地，所述支持介质为酶标板。具体实施方式以下，对本专利技术的实施方式进行说明。实施例1单抗的制备1.1口蹄疫抗原(A/AKT-Ⅲ株FMDV灭活抗原)为实验室保存。1.2免疫脾细胞的制备取纯化好的抗原与等体积的佐剂充分混匀，注入小鼠体内，每只每次注射剂量为1ml，经过一免、二免、三免和增强免后，测小鼠血清中抗体滴度，将显示有足够抗体滴度(1:108)(ELISA效价)的小鼠作为免疫脾细胞的来源。测定抗体滴度的方法为ELISA检测方法。1.3骨髓瘤细胞的制备骨髓瘤细胞SP2/0细胞为实验室所保存。1.4细胞融合1.4.1饲养层细胞的制备：1.4.1.1准备：在进行细胞融合前2天，挑选健康BALB/c小鼠，放入单独的鼠笼中饥饿4h。选择培养液HAT(32mL，每板10mL，3块板/只鼠)37℃预热30min。鼠架、剪刀、镊子紫外照射消毒30min。1.4.1.2暴露腹膜：饥饿4h后的Balb/c小鼠被脱颈处死后，用75％酒精浸泡5min，对小鼠体表进行消毒。将小鼠固定在鼠架上，用镊子和剪刀将小鼠的皮肤和腹膜分离，腹膜完全暴露。1.4.1.3腹腔内细胞采集：将预热的32mL选择培养液HAT放入灭菌的平皿中，10mL注射器中吸入8mL培养液，用镊子夹起腹膜，针头刺入腹膜，镊子夹住针头，伸入腹腔，注射器缓慢的抽吸数次，待注射器中的液体呈微黄色后，注射器针头退出腹腔，摘下针头后将液体缓慢注入平皿中。处理小鼠，消毒操作台。1.4.1.4铺板：取本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种A/AKT-Ⅲ株口蹄疫病毒抗原的夹心ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：/n单域抗体sdAb-A，所述单域抗体sdAb-A序列如SEQ ID NO.1所示；/n单克隆抗体9C10，所述单克隆抗体9C10由分泌口蹄疫A型单克隆抗体杂交瘤细胞9C10株分泌，所述杂交瘤细胞9C10株保藏编号为CGMCC No.17081；/n封闭液；/n金标二抗；/n包被所述单域抗体sdAb-A的支持介质。/n

【技术特征摘要】
1.一种A/AKT-Ⅲ株口蹄疫病毒抗原的夹心ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：
单域抗体sdAb-A，所述单域抗体sdAb-A序列如SEQIDNO.1所示；
单克隆抗体9C10，所述单克隆抗体9C10由分泌口蹄疫A型单克隆抗体杂交瘤细胞9C10株分泌，所述杂交瘤细胞9C10株保藏编号为CGMCCNo.17081；
封闭液；
金标二抗；
包被所述单域抗体sdAb-A的支持介质。


2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述单域抗体sdAb-A包被浓度为1.3μg/mL。


3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述封闭液为5％脱脂乳。


4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述A/AKT-Ⅲ株FMDV单克隆抗体9C1...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘月，张涛，张晓慧，马红艳，武俊兰，刘延麟，李建丽，
申请(专利权)人：内蒙古必威安泰生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：内蒙古;15