用于检测牛副流感病毒3型抗体的阻断ELISA试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术公开一种用于检测牛副流感病毒3型抗体的阻断ELISA试剂盒，所述试剂盒包括预包被酶标板和酶标记抗体，所述预包被酶标板为采用纯化的山羊副流感病毒3型包被的酶标板，所述酶标记抗体为辣根过氧化物酶标记的单克隆抗体2E6，所述单克隆抗体2E6由杂交瘤细胞株2E6分泌，所述杂交瘤细胞株2E6于2016年2月1日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：C201627，分类命名杂交瘤细胞株2E6。本发明专利技术的试剂盒特异性好、灵敏度高、稳定性好，可快速、简便、高效的检测牛副流感病毒3型抗体，且成本低，适合样品的高通量检测。

【技术实现步骤摘要】
用于检测牛副流感病毒3型抗体的阻断ELISA试剂盒及其应用
本专利技术涉及生物检测领域，涉及一种用于检测牛副流感病毒3型抗体的阻断ELISA试剂盒及其应用。
技术介绍
牛副流感病毒3型(Bovineparainfluenzavirustype3，BPIV3)属于副黏病毒科呼吸道病毒属，是有囊膜的单股负链RNA病毒。该属病毒成员除了BPIV3，还包括人副流感病毒1型和3型(HPIV1，HPIV3)、山羊副流感病毒3型(CPIV3)、绵羊副流感病毒3型(OPIV3)等，是导致人和动物呼吸道疾病的重要病原。BPIV3是牛呼吸道综合征的主要病原，感染后多造成急性的临床症状，出现体温升高、食欲不振、精神萎靡、流涕、咳嗽、呼吸困难等，对育肥牛的危害极大。目前，BPIV3流行于世界各国，在美洲、欧洲、亚洲各国均不断发生或流行。近年来，我国山东、黑龙江、辽宁和内蒙古等多个省份均有发生，导致养牛业蒙受重大的经济损失。BPIV3作为重要的呼吸道疾病病原，在病原学检测方面，主要依赖于荧光定量RT-PCR技术，用于快速定量检测BPIV3。此外，也建立了检测牛病毒性腹泻病毒、BPIV3和牛呼吸道合胞体病毒3种病毒的多重RT-PCR诊断方法，该方法特异、快速、准确的特点，可用于3种病毒的同时鉴定。在血清学诊断技术中，中和实验是该病常用的血清学诊断方法，同时也是该病血清学诊断的金标准，具有极高的可信度。血凝抑制试验由于成本低、操作简便也是BPIV3抗体检测的常用方法。此外，国内也建立了检测BPIV3抗体的间接ELISA方法，可用于临床样品的高通量检测。如李德栋等建立了间接ELISA用于检测牛副流感病毒3型血清抗体，其敏感性为1:1280，同时牛传染性鼻气管炎病毒和牛病毒性腹泻病毒阳性血清无交叉反应，检测符合率98.9％；杨建乐等同样建立了牛副流感病毒3型抗体间接ELISA检测方法(4.杨建乐,赵贵民,侯佩莉,王洪梅,李杰,何洪彬.牛副流感病毒3型抗体间接ELISA检测方法的建立与初步应用[J].动物医学进展,2016,37(11):19-24.)，结果表明牛的主要呼吸道病原如牛病毒性腹泻病毒、牛传染性鼻气管炎病毒等均无交叉反应,批内和批间重复性试验的变异系数小于8％；建立间接ELISA诊断方法与血清中和试验比较,总体总符合率为96.67％；与美国爱德士BPIV3间接ELISA试剂盒比较,总体符合率为95.56％；吕闯等提出了牛副流感病毒3型NP单抗制备及固相阻断ELISA的建立和应用(吕闯，牛副流感病毒3型NP单抗制备及固相阻断ELISA的建立和应用[D].中国农业科学院，2012)，对同为牛呼吸道病毒的IBRV和BVDV阳性牛血清进行SPB-ELISA，结果IBRV和BVDV阳性牛血清都没有阻断效果，表明该方法具有良好的特异性。敏感性试验结果表明该方法对病毒中和抗体效价大于1:32的血清阳性检出率为100％。用3份阳性血清与3份阴性血清进行批内重复试验和批间重复试验，根据试验结果计算变异系数，变异系数均小于10％，表明该方法具有良好的重复性。利用SPB-ELISA对经病毒中和试验检测的已知阳性的100份血清样品进行检测，结果阳性检出率为93％，表明该方法与病毒中和试验具有较高的符合率。专利CN201611078635.9提出了一种检测牛副流感病毒3型抗体的间接竞争酶联适配体方法，结果表明牛呼吸道合胞体病毒、牛冠状病毒、牛传染性支气管炎病毒感染牛的阳性血清进行Ic-ELAA试验，无交叉。Ic-ELAA方法与商品化试剂盒的符合率88％。CN201410225816.4提出了一种检测牛副流感病毒3型抗体的表达蛋白及ELISA试剂盒，48份疑似有交叉反应的参考血清，检测结果全部为阴性。对阳性参考血清检出阳性的最大稀释倍数均为200～300倍。应用该ELISA试剂盒对临床采集的100份血清样品进行检测，同时利用间接免疫荧光试验方法进行同步检测，进而比较牛副流感病毒3型ELISA抗体检测试剂盒与免疫荧光方法的符合率。可见两种方法检测样品的阳性符合率为87％，阴性符合率为91.7％。总符合率为89.35％。上述检测方法虽然大大提高了检测效率，但敏感性和符合率有待于进一步提高。自1975年Kohler和Milstein建立了单克隆抗体技术以来，单克隆抗体作为检测技术开发的一种重要工具，在人和动物病原的抗体和抗原检测中发挥了重要作用。与多克隆抗体相比，单克隆抗体具有以下优势：(1)针对单一抗原表位；(2)无限复制及生产。利用单克隆抗体建立的阻断ELISA检测方法，在动物传染病的监测和预防方面发挥着重要作用。目前国内外尚无针对牛副流感病毒3型(BPIV3)抗体的阻断ELISA检测方法，本专利技术旨在建立检测BPIV3抗体的阻断ELISA检测试剂盒，为临床检测和相关研究奠定基础。
技术实现思路
专利技术目的：为解决现有技术中存在的技术问题，本专利技术提供一种检测牛副流感病毒3型抗体的阻断ELISA试剂盒，该试剂盒特异性好、灵敏度高、稳定性好，可快速、简便、高效的检测牛副流感病毒3型抗体，且成本低，适合样品的高通量检测。为实现上述目的，本专利技术的技术方案如下：一种用于检测牛副流感病毒3型抗体的阻断ELISA试剂盒，所述试剂盒包括预包被酶标板和酶标记抗体，所述预包被酶标板为采用纯化的山羊副流感病毒3型(CPIV3)包被的酶标板，所述酶标记抗体是辣根过氧化物酶标记的单克隆抗体2E6，所述单克隆抗体2E6由杂交瘤细胞株2E6分泌，所述杂交瘤细胞株2E6于2016年2月1日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCCNO：C201627，分类命名杂交瘤细胞株2E6。其中，杂交瘤细胞株2E6的抗原为CPIV3病毒JS2013株。进一步地，所述所述试剂盒还包括样品稀释液、显色液、终止液和洗涤液。优选地，所述样品稀释液为含有1％牛血清白蛋白(BSA)和0.02％硫柳汞钠的0.01mM、pH值为7.4的PBS缓冲液。优选地，所述洗涤液的溶剂是0.01mM、pH值为7.4的PBS缓冲液，溶质为吐温-20，吐温-20在洗涤液中的体积百分浓度为0.1％。优选地，所述终止液为2M的硫酸水溶液。优选地，所述显色液为TMBonesolution试剂。在一些实施例中，所述酶标记抗体制备方法如下：(1)取5mg辣根过氧化物酶溶于纯水，加入0.2ml、0.1M的NaIO4溶液，室温反应30分钟；(2)将5mg纯化后的单克隆抗体2E6用偶联缓冲液(pH9.5、10mM的碳酸盐缓冲液)透析过夜；(3)将步骤(1)所得溶液加入步骤(2)透析后所得抗体溶液中，室温反应2小时；(4)加入硼氢化钠封闭反应位点；(5)磷酸盐缓冲液透析过夜，得到酶标记抗体，加入等量甘油保存于-20℃。在一些实施方式中，纯化的山羊副流感病毒CPIV3JS2013株的包被量为1:200～1:600(HA血凝价为213)，酶标单克隆抗体2E6的浓度为5.25～42μg/mL。本专利技术同时提出了上本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于检测牛副流感病毒3型抗体的阻断ELISA试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括预包被酶标板和酶标记抗体，所述预包被酶标板为采用纯化的山羊副流感病毒3型包被的酶标板，所述酶标记抗体为辣根过氧化物酶标记的单克隆抗体2E6，所述单克隆抗体2E6由杂交瘤细胞株2E6分泌，所述杂交瘤细胞株2E6于2016年2月1日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学，保藏编号为 CCTCC NO：C201627，分类命名杂交瘤细胞株2E6。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于检测牛副流感病毒3型抗体的阻断ELISA试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括预包被酶标板和酶标记抗体，所述预包被酶标板为采用纯化的山羊副流感病毒3型包被的酶标板，所述酶标记抗体为辣根过氧化物酶标记的单克隆抗体2E6，所述单克隆抗体2E6由杂交瘤细胞株2E6分泌，所述杂交瘤细胞株2E6于2016年2月1日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCCNO：C201627，分类命名杂交瘤细胞株2E6。


2.根据权利要求1所述的阻断ELISA试剂盒，其特征在于，所述所述试剂盒还包括样品稀释液、显色液、终止液和洗涤液。


3.根据权利要求2所述的阻断ELISA试剂盒，其特征在于，所述样品稀释液为含有1%牛血清白蛋白（m/v）和0.02%硫柳汞钠（m/v）的0.01mM、pH值为7.4的PBS缓冲液。


4.根据权利要求2所述的阻断ELISA试剂盒，其特征在于，所述洗涤液的溶剂是0.01mM、pH值为7.4的PBS缓冲液，溶质为吐温-20，吐温-20在洗涤液中的体积百分浓度为0.1%。


5.根据权利要求2所述的阻...

【专利技术属性】
技术研发人员：毛立，李文良，李基棕，刘茂军，杨蕾蕾，张纹纹，孙敏，
申请(专利权)人：江苏省农业科学院，
类型：发明
国别省市：江苏;32