一种禽流感病毒纯化的方法技术

本发明专利技术公开了一种禽流感病毒纯化的方法，具体包括如下步骤：两次过滤：采用不锈钢筛网对收获的含禽流感病毒抗原的半成品胚液进行两次过滤；离心：滤出液进行离心，收集上清液和沉淀；溶解：沉淀中加入PBS溶液重新溶解，并且搅拌，得到溶液；离心：溶液进行离心，收集上清液；浓缩：采用孔径为30-500K的膜包对上清液进行浓缩；分子筛层析：以葡聚糖凝胶G200为层析填料，采用纯净水平衡层析柱，以0.05M的PBS溶液为洗脱液，对浓缩液进行分子筛层析，回收禽流感病毒液；浓缩：采用膜包对回收禽流感病毒液使用进行浓缩，获得纯化后的禽流感病毒。该方法处理量大，处理速度快，能够去除胚液中80％以上的异源蛋白，病毒回收率大于85％，并且不影响病毒HA效价。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及兽用生物制品行业的兽用疫苗制造领域，更具体地说，涉及一种禽流感病毒纯化的方法。
技术介绍
禽流感是一种由A型流感病毒引起的传染性疾病综合征，被国际兽疫局定为A类传染病。按病原性的致病力，禽流感可分为高致病性、低致病性和非致病性三大类。非致病性禽流感不会引起明显症状，仅使染病的禽鸟体内产生病毒抗体。低致病性禽流感可使禽类出现轻度呼吸道症状，食量减少、产蛋量下降，出现零星死亡。高致病性禽流感最为严重，发病率和死亡率高。禽流感疫苗主要通过鸡胚繁殖病毒而生产。该种疫苗具有制备工艺简单，免疫效果确实，免疫持续时间较长等特点，己被许多国家地区在家禽中使用，并在预防和控制禽流感暴发中起到一定积极作用。在规模化生产禽流感油乳剂灭活苗中，通过对原辅材料、生产过程关键技术地控制和工艺改进等措施，生产出高效、稳定的产品。生产过程的关键技术直接关系到产品的质量，是生产高效优质产品的保障。鸡胚含有大量的蛋白、脂类、细胞碎片等杂质，这些物质和病毒抗原结合在一起。这些异源性物质容易引起的鸡应激，降低生产性能，例如生长缓慢、产蛋量下降等，在蛋鸡上表现尤为明显。因此，为了提高禽流感疫苗的品质有必要去除胚液中部分异源性物质。目前，有许多研究致力于从胚液中纯化病毒或者生产相应产品。有人通过乙醚等化学试剂从浓缩的胚液中提取病毒提高病毒产量。提取病毒的目的在于，病毒颗粒与细胞碎片或者块状物质分离开。有人>通过离子交换层析分离病毒；也有人通过，通过中等速度离心去除胚液中的大块物质，然后通过CaHPO4凝胶吸附澄清胚液中的病毒颗粒，达到纯化病毒的目的。有人研究发现，流感病毒液中加入0.3MNaCl降低纯化后的流感病毒聚集。虽然有不少人对采用了不同方法对禽流感病毒进行了分离纯化，但是这些方法明显存在以下缺点：处理量小，例如高速离心，回收率低，对病毒抗原存在影响，例如使用乙醚等化学试剂从浓缩的胚液中提取病毒。这些因素均不利于产业化。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题在于，针对现有技术的上述缺陷，提供一种禽流感病毒纯化的方法，该方法处理量大，处理速度快，能够去除胚液中80％以上的异源蛋白，病毒回收率大于85％，并且不影响病毒HA效价。本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：提供一种禽流感病毒纯化的方法，具体包括如下步骤：(1)一次过滤：采用不锈钢筛网对收获的含禽流感病毒抗原的半成品胚液进行一次过滤，收集滤出液A；(2)二次过滤：采用不锈钢筛网对步骤(1)中滤出液A进行二次过滤，收集滤出液B；(3)离心：对步骤(2)的滤出液B进行离心，收集上清液C和沉淀D；(4)溶解：在步骤(3)得到的沉淀D中加入0.1M的PBS溶液重新溶解，并且搅拌，得到溶液E；(5)离心：对步骤(4)得到的溶液E进行离心，收集上清液F；(6)浓缩：将步骤(3)与步骤(5)中得到的上清液C和上清液F合并，然后采用孔径为30-500K的膜包对合并液进行浓缩，浓缩至原始体积的(1/2)-(1/8)，得到浓缩液G；(7)分子筛层析：以葡聚糖凝胶G200为层析填料，采用纯净水平衡层析柱，以0.05M的PBS溶液为洗脱液，对步骤(6)中得到浓缩液G进行分子筛层析，回收禽流感病毒液H；(8)浓缩：采用孔径为30-500K的膜包对步骤(7)回收禽流感病毒液H使用进行浓缩，获得纯化后的禽流感病毒I。本专利技术所述的禽流感病毒纯化的方法，其中，所述步骤(1)中不锈钢筛网的目数为150-250目。本专利技术所述的禽流感病毒纯化的方法，其中，所述步骤(2)中不锈钢筛网的目数为550-550目。本专利技术所述的禽流感病毒纯化的方法，其中，所述步骤(3)中离心速度为4000-6000rmp/min，离心时间为30-60min。本专利技术所述的禽流感病毒纯化的方法，其中，所述步骤(4)中搅拌速度为6000-10000rpm/min，搅拌时间为30min-1h，加入的PBS溶液的体积与步骤(1)中的半成品胚液的体积相等。本专利技术所述的禽流感病毒纯化的方法，其中，所述步骤(5)中的离心速度为4000-6000rmp/min，离心时间为30-60min。本专利技术所述的禽流感病毒纯化的方法，其中，所述步骤(6)中膜包的孔径为100-300K。本专利技术所述的禽流感病毒纯化的方法，其中，所述步骤(8)中膜包的孔径为100-300K。实施本专利技术的禽流感病毒纯化的方法，具有以下有益效果：(1)根据本申请的纯化方法能够去除含禽流病毒胚液中80％以上的异源蛋白，并且禽流病毒回收率大于85％。说明本方法采用简单物理过程对禽流感病进行纯化，能够保持有效去除异源蛋白同时保留禽流感病毒；(2)另外，与未加PBS溶液的胚液相比，本专利技术加入0.1M和0.05M的PBS溶液进行处理后并未降低禽流感病毒血凝性(HA价)，由此可见，0.1M和0.05M的PBS溶液对禽流感病毒血凝性没有影响，说明本方法采用简单物理过程对禽流感病进行纯化，能够保持禽流感病毒原有的HA价，并未涉及到化学或者其它导致病毒变性。(3)与高速离心等不同纯化方法，本专利技术的纯化方法处理量大，处理速度快，回收率高。附图说明下面将结合附图及实施例对本专利技术作进一步说明，附图中：图1是本专利技术实施例1中经G200分子筛层析后的禽流感病毒液H的分离效果图；其中，具有两个峰值的曲线为禽流感病毒粗纯样品通过G200层析填料分离情况；具有一个峰值的曲线为溶液中电导(各种离子浓度)变化情况；黑色箭头为禽流感病毒峰。具体实施方式下面，结合附图以及具体实施方式，对本专利技术做进一步描述：一种禽流感病毒纯化的方法，具体包括如下步骤：(1)一次过滤：采用目数为150-250目的不锈钢筛网对收获的含禽流感病毒抗原的半成品胚液进行一次过滤，收集滤出液A；(2)二次过滤：采用目数为550-550目的不锈钢筛网对步骤(1)中滤出液A进行二次过滤，收集滤出液B；(3)离心：对步骤(2)的滤出液B进行离心，离心速度为4000-6000rmp/min，离心时间为30-60min，收集上清液C和沉淀D；(4)溶解：在步骤(3)得到的沉淀D中加入0.1M的PBS溶液重新溶解，并且搅拌，搅拌速度为6000-10000rpm/min，搅拌时间为30min-1h，加入的PBS溶液的体积与步骤(1)中的半成品胚液的体积相等，得到本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种禽流感病毒纯化的方法，其特征在于，具体包括如下步骤：(1)一次过滤：采用不锈钢筛网对收获的含禽流感病毒抗原的半成品胚液进行一次过滤，收集滤出液A；(2)二次过滤：采用不锈钢筛网对步骤(1)中滤出液A进行二次过滤，收集滤出液B；(3)离心：对步骤(2)的滤出液B进行离心，收集上清液C和沉淀D；(4)溶解：在步骤(3)得到的沉淀D中加入0.1M的PBS溶液重新溶解，并且搅拌，得到溶液E；(5)离心：对步骤(4)得到的溶液E进行离心，收集上清液F；(6)浓缩：将步骤(3)与步骤(5)中得到的上清液C和上清液F合并，然后采用孔径为30‑500K的膜包对合并液进行浓缩，浓缩至原始体积的(1/2)‑(1/8)，得到浓缩液G；(7)分子筛层析：以葡聚糖凝胶G200为层析填料，采用纯净水平衡层析柱，以0.05M的PBS溶液为洗脱液，对步骤(6)中得到浓缩液G进行分子筛层析，回收禽流感病毒液H；(8)浓缩：采用孔径为30‑500K的膜包对步骤(7)回收禽流感病毒液H使用进行浓缩，获得纯化后的禽流感病毒I。

【技术特征摘要】
1.一种禽流感病毒纯化的方法，其特征在于，具体包括如下步
骤：
(1)一次过滤：采用不锈钢筛网对收获的含禽流感病毒抗原的
半成品胚液进行一次过滤，收集滤出液A；
(2)二次过滤：采用不锈钢筛网对步骤(1)中滤出液A进行二
次过滤，收集滤出液B；
(3)离心：对步骤(2)的滤出液B进行离心，收集上清液C和
沉淀D；
(4)溶解：在步骤(3)得到的沉淀D中加入0.1M的PBS溶液
重新溶解，并且搅拌，得到溶液E；
(5)离心：对步骤(4)得到的溶液E进行离心，收集上清液F；
(6)浓缩：将步骤(3)与步骤(5)中得到的上清液C和上清
液F合并，然后采用孔径为30-500K的膜包对合并液进行浓缩，浓缩
至原始体积的(1/2)-(1/8)，得到浓缩液G；
(7)分子筛层析：以葡聚糖凝胶G200为层析填料，采用纯净水
平衡层析柱，以0.05M的PBS溶液为洗脱液，对步骤(6)中得到浓
缩液G进行分子筛层析，回收禽流感病毒液H；
(8)浓缩：采用孔径为30-500K的膜包对步骤(7)回收禽流感
病毒液H使用进行浓缩，获得纯化后的禽流感病毒I。
2.根据权...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈瑞爱，张爱国，徐家华，汤钦，
申请(专利权)人：华南农业大学，肇庆大华农生物药品有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44