基于Taqman探针的慢性肾脏病相关基因检测荧光定量PCR一步法试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种基于Taqman探针的慢性肾脏病相关基因检测荧光定量PCR一步法试剂盒及其应用，该试剂盒包括检测VIM、BCL2、PODLX和TGFB1基因的上下游引物及探针，还包括检测B2M内参基因的上下游引物及探针。本发明专利技术荧光定量PCR试剂盒具有取材量小、操作简便且检测周期短的优点，能够用于慢性肾脏病多种相关发病基因的快速检测。同时在检测过程中mRNA逆转录及荧光定量一步完成，均在单管中进行，勿需打开管盖，荧光信号的产生不仅强烈依赖于靶模板同探针的杂交，而且同时强烈依赖于靶模板的扩增，故不存在非特异性扩增现象。从而可快速、特异、灵敏地检测慢性肾脏病相关基因的mRNA表达水平。

Detection of chronic kidney disease related genes based on Taqman probe fluorescent quantitative PCR one-step kit and its application

The invention discloses a method of detecting chronic kidney disease related gene Taqman probe fluorescence quantitative PCR kit and its application based on one step, the kit includes a primer and probe for detection of VIM, BCL2, PODLX and TGFB1 genes, including the primers and B2M probe detection reference gene. The fluorescent quantitative PCR kit has the advantages of small sampling amount, simple operation and short detection cycle, and can be used for rapid detection of multiple pathogenic genes in chronic kidney disease. At the same time in the process of detection and fluorescence quantitative reverse transcription mRNA in one step, were performed in a single tube, does not need to open the tube cover, hybridization fluorescence signal not only strongly depends on the target template with the probe, and at the same time was strongly dependent on the target template, so there is no non-specific amplification phenomenon. Thus, the mRNA expression level of chronic kidney disease related genes can be detected rapidly, specifically and sensitively.

【技术实现步骤摘要】
基于Taqman探针的慢性肾脏病相关基因检测荧光定量PCR一步法试剂盒及其应用
本专利技术涉及生物医学领域，具体涉及一种基于Taqman探针的慢性肾脏病相关基因检测荧光定量PCR一步法试剂盒及其应用。
技术介绍
慢性肾脏病(CKD)是由各种原因引起的慢性肾脏结构和功能障碍，包括肾脏病理损伤、血液或尿液成分异常，及影像学检查异常，或肾小球滤过率(GFR)下降(<60ml/min·1.73m2)超过3个月。肾脏纤维化是慢性肾脏病(CKD)进展为终末期肾病(ESKD)的关键病理改变，其特征为肾脏固有细胞受损、丢失，并出现大量胶原沉积和积聚。肾功能指标(如血清肌酐等)、尿蛋白定量以及肾穿刺活检是目前临床上最常用的慢性肾脏病及肾脏纤维化诊断方法。然而由于肾脏有较强的代偿能力，肾功能指标不能反映早期纤维化及其严重程度。尿蛋白检测受诸多因素影响，且主要反映肾小球损害，不能反映肾脏间质纤维化程度。而肾活检为创伤性检查，可引起出血等并发症，不宜用于早期筛查及长期监测。信使核糖核酸(mRNA)由DNA的一条链作为模板转录而来的、能指导蛋白质合成的一类单链核糖核酸。已有大量研究证明在慢性肾脏病发生发展过程中，肾脏固有细胞内众多mRNA表达水平改变。研究表明，VIM、BCL2、PODLX以及TGFB1基因在慢性肾脏病发生发展过程中起重要作用，检测相应mRNA水平对慢性肾脏病的分子病理分型及预后监测具有独特价值。基于Taqman探针的荧光定量PCR技术通过Taqman探针与模板的特异性杂交来鉴别模板，具有很高的准确性，假阳性率低，特异性好。专利技术目的
技术实现思路
：针对现有技术存在的问题，本专利技术提供一种基于Taqman探针的慢性肾脏病相关基因检测荧光定量PCR一步法试剂盒。该荧光定量PCR试剂盒具有取材量小、操作简便且检测周期短的优点，能够用于慢性肾脏病相关发病基因的快速检测。本专利技术还提供该基于Taqman探针的慢性肾脏病相关基因检测荧光定量PCR试剂盒的应用。技术方案：为了实现上述目的，如本专利技术所述一种基于Taqman探针的慢性肾脏病相关基因检测荧光定量PCR一步法试剂盒，包括检测VIM基因的上下游引物及探针，其核苷酸序列如SEQIDNO1-3所示；检测BCL2基因的上下游引物及探针，其核苷酸序列如SEQIDNO4-6所示；检测PODLX基因的上下游引物及探针，其核苷酸序列如SEQIDNO7-9所示；检测TGFB1基因的上下游引物及探针，其核苷酸序列如SEQIDNO10-12所示；检测B2M内参基因的上下游引物及探针，其核苷酸序列如SEQIDNO12-15所示。其中，所述PCR试剂盒还包括PCR酶混合液和MasterMix。所述PCR酶混合液为m-mlv逆转录酶和RNaseinhibitor混合液。所述MasterMix包含浓度为75mM～125mM的KCl，浓度为4mM～8mM的MgCl2，浓度为20mM～100mM、pH为7.9～8.3的Tris-HCl，浓度为0.2uM～0.8uM的dNTPs，浓度为0.02U～0.1U/ul的热启动Taq酶，0.125×到1×之间的SYBRGreenI，以及适量的PCR增强剂。其中，所述VIM、BCL2、PODLX、TGFB1和B2M基因的探针连接的荧光基团为：FAM-BHQ1。进一步地，所述探针5’端标记的荧光报告基团是FAM，3’端连接淬灭基团。更进一步地，所述淬灭基团为BHQ1非荧光淬灭基团。本专利技术所述的基于Taqman探针的慢性肾脏病相关基因检测荧光定量PCR试剂盒在分别检测基因VIM、BCL2、PODLX、TGFB1和B2M中的应用。其中，所述检测基因时PCR反应体系为10ul，包括提取的样本RNA1ul，上下游引物和探针混合液3.5ul，PCR酶混合液0.5ul，MasterMix5ul。其中，上下游引物和探针混合液中上下游引物浓度为0.6uM～1.5uM，探针浓度为0.3uM～1uM；PCR酶混合液中m-mlv逆转录酶浓度为200～3000U/ul,RNaseinhibitor浓度为40～1200U/ul；MasterMix包含浓度为75mM～125mM的KCl，浓度为4mM～8mM的MgCl2，浓度为20mM～100mM、pH为7.9～8.3的Tris-HCl，浓度为0.2uM～0.8uM的dNTPs，浓度为0.02U～0.1U/ul的热启动Taq酶，0.125×到1×之间的SYBRGreenI，以及适量的PCR增强剂。所述检测基因时荧光定量PCR反应条件为：42℃5min；95℃10min；95℃20s；60℃退火/延伸45s，循环45次；40℃冷却30s。本专利技术根据NCBI上的VIM、BCL2、PODLX、TGFB1以及B2M(内参基因)基因全序列，并据此设计特异性引物和TaqMan探针，设计特点如下：1、引物的设计通过跨内含子设计引物的方式最大程度避免了基因组的干扰；2、引物和探针都和全转录组、全基因组进行细致比对，有效避免了非特异的结合；3、引物和探针结构都进行了小心的设计，避免互相之间的干扰；4、引物尽量覆盖目标基因的各种转录本，以达到最佳检测效果。最后采用荧光定量PCR快速技术检测基因表达。有益效果：与现有技术相比，本专利技术荧光定量PCR试剂盒具有取材量小、操作简便且检测周期短的优点，能够用于慢性肾脏病相关发病基因的快速检测。同时在检测过程中mRNA逆转录及荧光定量一步完成，均在单管中进行，勿需打开管盖，荧光信号的产生不仅强烈依赖于靶模板同探针的杂交，而且同时强烈依赖于靶模板的扩增，故不存在非特异性扩增现象。从而可快速、特异、灵敏地检测慢性肾脏病相关基因的mRNA表达水平。附图说明图1是本专利技术的荧光定量PCR试剂盒检测VIM、BCL2、PODLX及TGFB1四种mRNA在慢性肾脏病患者及健康人群尿液中的差异表达示意图；图2是本专利技术的荧光定量PCR试剂盒检测VIM溶解曲线图；图3是本专利技术的荧光定量PCR试剂盒检测BCL2溶解曲线图；图4是本专利技术的荧光定量PCR试剂盒检测PODLX溶解曲线图；图5是本专利技术的荧光定量PCR试剂盒检测TGFB1溶解曲线图；图6是本专利技术的荧光定量PCR试剂盒检测B2M溶解曲线图。具体实施方式以下结合附图和实施例对本专利技术作进一步说明。实施例1一种基于Taqman探针的慢性肾脏病相关基因检测荧光定量PCR试剂盒，包括检测VIM基因的上下游引物及探针，其核苷酸序列如SEQIDNO1-3所示；检测BCL2基因的上下游引物及探针，其核苷酸序列如SEQIDNO4-6所示；检测PODLX基因的上下游引物及探针，其核苷酸序列如SEQIDNO7-9所示；检测TGFB1基因的上下游引物及探针，其核苷酸序列如SEQIDNO10-12所示；检测B2M内参基因的上下游引物及探针，其核苷酸序列如SEQIDNO12-15所示。序列SEQIDNO1-15如下表1所示：表1引物序列和探针序列试剂盒中还包括所述PCR试剂盒还包括PCR酶混合液和MasterMix。PCR酶混合液为m-mlv逆转录酶和RNaseinhibitor混合液。试剂盒中配置好上下游引物和探针混合液、PCR酶混合液和MasterMix。其中，上下游引物和探针混合液中上下游引物浓度为0.6本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于Taqman探针的慢性肾脏病相关基因检测荧光定量PCR一步法试剂盒，其特征在于，包括检测VIM基因的上下游引物及探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO 1‑3所示；检测BCL2基因的上下游引物及探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO 4‑6所示；检测PODLX基因的上下游引物及探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO 7‑9所示；检测TGFB1基因的上下游引物及探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO 10‑12所示；检测B2M内参基因的上下游引物及探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO 12‑15所示。

【技术特征摘要】
1.一种基于Taqman探针的慢性肾脏病相关基因检测荧光定量PCR一步法试剂盒，其特征在于，包括检测VIM基因的上下游引物及探针，其核苷酸序列如SEQIDNO1-3所示；检测BCL2基因的上下游引物及探针，其核苷酸序列如SEQIDNO4-6所示；检测PODLX基因的上下游引物及探针，其核苷酸序列如SEQIDNO7-9所示；检测TGFB1基因的上下游引物及探针，其核苷酸序列如SEQIDNO10-12所示；检测B2M内参基因的上下游引物及探针，其核苷酸序列如SEQIDNO12-15所示。2.根据权利要求1所述的基于Taqman探针的慢性肾脏病相关基因检测荧光定量PCR一步法试剂盒，其特征在于，所述PCR试剂盒还包括PCR酶混合液和MasterMix。3.根据权利要求1所述的基于Taqman探针的慢性肾脏病基因检测荧光定量PCR一步法试剂盒，其特征在于，所述VIM、BCL2、PODLX、TGFB1和B2M基因的探针连接的荧光基团为：FAM-BHQ1。...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘必成，周乐汀，雷向东，
申请(专利权)人：东南大学，上海境象生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32