一种ADH2*2基因型检测试剂盒及其检测方法技术

一种ADH2*2基因型检测试剂盒及其检测方法，其特征在于：包括KOD DNA聚合酶、上游引物、下游引物、特异性靶向荧光探针、GG型阳性参考品、AA型阳性参考品以及AG型阳性参考品；GG纯合型DNA序列是以人ADH2*2基因143位点GG型为模板而设计的一段线性重组DNA序列；AA纯合型DNA序列是以人ADH2*2基因143位点AA型为模板而设计的一段线性重组DNA序列；AG型阳性参考品是通过GG型阳性参考品与AA型阳性参考品按等体积混合配制而成。本发明专利技术的检测方法能够快速、简便地检测ADH2*2基因第143位点的变异。

ADH2*2 genotype detection kit and detection method thereof

A ADH2*2 genotype detection kit and detection method thereof, which comprises KOD DNA polymerase, upstream primer and downstream primers, targeting fluorescence probe, GG positive reference, AA positive and AG positive reference reference; GG homozygous DNA sequence is a linear recombinant DNA sequence in the ADH2*2 gene 143 site type GG as the template and design; AA homozygous DNA sequence is a linear sequence of recombinant DNA in human ADH2*2 gene 143 site type AA as the template and design; AG positive reference by GG positive reference and AA positive reference to volume mixedcompounded. The detection method can rapidly and conveniently detect the variation of the ADH2*2 gene 143rd locus.

【技术实现步骤摘要】
一种ADH2*2基因型检测试剂盒及其检测方法
本专利技术涉及分子生物学
，具体涉及一种ADH2*2基因型检测试剂盒及其检测方法，该试剂盒采用PCR体外扩增法，用于定性检测人全血样本中乙醛脱氢酶ADH2*2第143位点的基因多态性。
技术介绍
乙醇脱氢酶（Alcoholdehydrogenase，简称ADH）的系统名为乙醇：辅酶I氧化还原酶（alcohol：NAD+oxidoreductase），大量存在于人和动物肝脏、植物及微生物细胞之中，是一种含锌金属酶，具有广泛的底物特异性。在人和哺乳动物体内，乙醇脱氢酶（ADH）与乙醛脱氢酶（ALDH）构成了乙醇脱氢酶系，参与体内乙醇代谢，是人和动物体内重要的代谢酶。乙醇脱氢酶ADH2*2（G143A）负责催化人体的乙醇分解代谢，ADH的酶活性增强可以加速乙醇向乙醛转化，ADH2*2(G143A)的基因多态性导致携带ADH2*2等位基因的个体酒精代谢能力下降。因此，定性检测ADH2的基因多态性，可以用于筛选酒精代谢能力人群。目前临床或实验室检测ADH2基因多态性的方法包括PCR-直接测序法、PCR-焦磷酸测序法、荧光定量PCR法、PCR-基因芯片法、PCR-电泳分析、PCR-高分辨率熔解曲线法、等位基因特异性PCR法、PCR-限制性片段长度多态性方法、原位杂交（ISH）等多种方法。PCR-直接测序法也称PCR-Sanger测序。PCR-Sanger测序法的操作过程主要包括PCR扩增和PCR产物纯化、测序反应、测序和结果分析四个主要步骤。该方法属于定性检测。主要不足：灵敏度不高，尤其是在进行肿瘤组织体细胞突变检测时，当组织中靶标基因突变比例低于20％时，可能出现假阴性结果；对试剂和仪器有特殊要求，不易普及；操作复杂，成本相对较高，速度慢、通量低。PCR-焦磷酸测序法需设计一条生物素标记的测序引物，当引物与单链模板DNA退火后，在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶4种酶的协同作用下，将引物上每一个dNTP的聚合与一次荧光信号的释放偶联起来，通过检测荧光的释放和强度，达到实时测定DNA序列的目的。主要缺点：对试剂和仪器有特殊要求，不易普及；检测灵敏度有限，对肿瘤组织中的低丰度体细胞突变（<3％）容易出现假阴性；测序长度仅10多个碱基，不能对长片段进行分析。实时荧光PCR法可分为探针法和非探针法两种，前者利用与靶序列特异杂交的探针（Taqman和分子信标）来指示扩增产物的增加，后者利用荧光染料或特殊设计的引物来指示扩增产物的增加。实时荧光PCR法灵敏度高，分型准确，操作简便快捷，所用仪器容易普及，易于推广使用。但该方法通量不高，探针成本较高，单个位点的检测成本与样本量有关，样本量越小，成本越高。本方法主要适于对少量位点、大样本进行分型。PCR-基因芯片法以特定的寡核苷酸片段作为探针，将其有规律地排列固定于支持物上，然后将样品DNA通过PCR扩增、荧光标记等程序，按碱基配对原理与芯片杂交，再通过荧光检测系统对芯片上的荧光信号进行检测和分析，从而迅速获得个体的基因型信息。该方法用于DNA基因分型时属于定性检测，灵敏度为50ng/μL。PCR-电泳分析是指对待分析的目的基因片段进行PCR扩增，并通过琼脂糖凝胶电泳或毛细管电泳分析，根据PCR产物的大小对基因多态性位点进行基因分型。PCR过程中需建立阳性质控品和阴性质控品，电泳分析时需同时用分子量标记物进行片段大小的判断。当分子量标记物反应管无条带或出现较弱的条带时，可能的原因包括点样孔漏、荧光染料不够或失效、电泳时间过长或电压过大。该方法的优点是成本低，在普通实验室即可开展；缺点是只适合对DNA插入/缺失多态性或融合基因进行定性测定，不能用于SNP的检测。
技术实现思路
本专利技术旨在提供一种ADH2*2基因型检测试剂盒及其检测方法，利用该试剂盒能够快速、简便地检测ADH2*2基因第143位点的类型。为达到上述目的，本专利技术采用的技术方案是：一种ADH2*2基因型检测试剂盒，包括KODDNA聚合酶、上游引物、下游引物、特异性靶向荧光探针、GG型阳性参考品、AA型阳性参考品以及AG型阳性参考品；所述上游引物为针对人ADH2*2基因设计的上游引物，上游引物的序列为5’-CCTTCTCCAACACTCTCCACGATGC-3’（如SEQNO:1所示）；所述下游引物为针对人ADH2*2基因设计的下游引物，下游引物的序列为5’-GAATCTGAACAGCTTCTCTTTATTCTGTAGA-3’（如SEQNO:2所示）；所述特异性靶向荧光探针是带有人ADH2*2基因的特异性配对序列的探针，其碱基序列为5’-TCTGTCGCACAGATGACCAC-3’（如SEQNO:3所示），荧光染料为氟硼二吡咯；所述GG型阳性参考品是一种以GG纯合型DNA序列为主要成分的溶液，所述GG纯合型DNA序列是以人ADH2*2基因143位点GG型为模板而设计的一段线性重组DNA序列，GG纯合型DNA序列为5’-TCTTTTCTGAATCTGAACAGCTTCTCTTTATTCTGTAGATGGTGGCTGTAGGAATCTGTCGCACAGATGACCACGTGGTTAGTGGCAACCTGGTGACCCCCCTTCCTGTGATTTTAGGCCATGAGGCAGCCGGCATCGTGGAGAGTGTTGGAGAAGGGGT-3’（如SEQNO:4所示），其中，带有下划线的碱基位点是人ADH2*2基因的143位点，所述143位点用于表征人ADH2*2基因的GG型可突变为人ADH2*2基因的AA型的位置；所述AA型阳性参考品是一种以AA纯合型DNA序列为主要成分的溶液，所述AA纯合型DNA序列是以人ADH2*2基因143位点AA型为模板而设计的一段线性重组DNA序列，AA纯合型DNA序列为5’-TCTTTTCTGAATCTGAACAGCTTCTCTTTATTCTGTAGATGGTGGCTGTAGGAATCTGTCACACAGATGACCACGTGGTTAGTGGCAACCTGGTGACCCCCCTTCCTGTGATTTTAGGCCATGAGGCAGCCGGCATCGTGGAGAGTGTTGGAGAAGGGGT-3’（如SEQNO:5所示），其中，带有下划线的碱基位点是人ADH2*2基因的143位点，所述143位点用于表征人ADH2*2基因的AA型可突变为人ADH2*2基因的GG型的位置；所述AG型阳性参考品是通过所述GG型阳性参考品与AA型阳性参考品按等体积混合配制而成，所述GG型阳性参考品含有的GG纯合型DNA序列的浓度等于所述AA型阳性参考品含有的AA纯合型DNA序列的浓度。上述技术方案中的有关内容解释如下：1、上述方案中，KODDNA聚合酶是从鹿儿岛县小宝岛的含硫气孔中分离出来的超嗜热原始菌ThermococcuskodakaraensisKOD1提取纯化出来的，具有很强的3'→5'核酸外切酶活性(校正活性)，保真性约为TaqDNAPolymerase的50倍。具有1Kb/30s以上的DNA合成速度，该速度是最为普通的Taq聚合酶的两倍。另外，持续合成能力等较为优秀也是其伸长速度很快的主要原因之一。采用KODDNA聚合本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种ADH2*2基因型检测试剂盒，其特征在于：包括KOD DNA 聚合酶、上游引物、下游引物、特异性靶向荧光探针、GG型阳性参考品、AA型阳性参考品以及AG型阳性参考品；所述上游引物为针对人ADH2*2基因设计的上游引物，上游引物的序列为5’‑CCTTCTCCAACACTCTCCACGATGC‑3’；所述下游引物为针对人ADH2*2基因设计的下游引物，下游引物的序列为5’‑GAATCTGAACAGCTTCTCTTTATTCTGTAGA‑3’；所述特异性靶向荧光探针是带有人ADH2*2基因的特异性配对序列的探针，其碱基序列为5’‑TCTGTCGCACAGATGACCAC‑3’，荧光染料为氟硼二吡咯；所述GG型阳性参考品是一种以GG纯合型DNA序列为主要成分的溶液，所述GG纯合型DNA序列是以人ADH2*2基因143位点GG型为模板而设计的一段线性重组DNA序列，GG纯合型DNA序列为5’‑TCTTTTCTGAATCTGAACAGCTTCTCTTTATTCTGTAGATGGTGGCTGTAGGAATCTGTC

【技术特征摘要】
1.一种ADH2*2基因型检测试剂盒，其特征在于：包括KODDNA聚合酶、上游引物、下游引物、特异性靶向荧光探针、GG型阳性参考品、AA型阳性参考品以及AG型阳性参考品；所述上游引物为针对人ADH2*2基因设计的上游引物，上游引物的序列为5’-CCTTCTCCAACACTCTCCACGATGC-3’；所述下游引物为针对人ADH2*2基因设计的下游引物，下游引物的序列为5’-GAATCTGAACAGCTTCTCTTTATTCTGTAGA-3’；所述特异性靶向荧光探针是带有人ADH2*2基因的特异性配对序列的探针，其碱基序列为5’-TCTGTCGCACAGATGACCAC-3’，荧光染料为氟硼二吡咯；所述GG型阳性参考品是一种以GG纯合型DNA序列为主要成分的溶液，所述GG纯合型DNA序列是以人ADH2*2基因143位点GG型为模板而设计的一段线性重组DNA序列，GG纯合型DNA序列为5’-TCTTTTCTGAATCTGAACAGCTTCTCTTTATTCTGTAGATGGTGGCTGTAGGAATCTGTCGCACAGATGACCACGTGGTTAGTGGCAACCTGGTGACCCCCCTTCCTGTGATTTTAGGCCATGAGGCAGCCGGCATCGTGGAGAGTGTTGGAGAAGGGGT-3’，其中，带有下划线的碱基位点是人ADH2*2基因的143位点，所述143位点用于表征人ADH2*2基因的GG型可突变为人ADH2*2基因的AA型的位置；所述AA型阳性参考品是一种以AA纯合型DNA序列为主要成分的溶液，所述AA纯合型DNA序列是以人ADH2*2基因143位点AA型为模板而设计的一段线性重组DNA序列，AA纯合型DNA序列为5’-TCTTTTCTGAATCTGAACAGCTTCTCTTTATTCTGTAGATGGTGGCTGTAGGAATCTGTCACACAGATGACCACGTGGTTAGTGGCAACCTGGTGACCCCCCTTCCTGTGATTTTAGGCCATGAGGCAGCCGGCATCGTGGAGAGTGTTGGAGAAGGGGT-3’，其中，带有下划线的碱基位点是人ADH2*2基因的143位点，所述143位点用于表征人ADH2*2基因的AA型可突变为人ADH2*2基因的GG型的位置；所述AG型阳性参考品是通过所述GG型阳性参考品与AA型阳性参考品按等体积混合配制而成，所述GG型阳性参考品含有的GG纯合型DNA序列的浓度等于所述AA型阳性参考品含有的AA纯合型DNA序列的浓度。2.根据权利要求1所述的一种ADH2*2基因型检测试剂盒，其特征在于：该ADH2*2基因型检测试剂盒还包括阳性质控品，阳性质控品是一种以碱基序列为主要成分的试剂，所述碱基序列是通过所述GG型阳性参考品与AA型阳性参考品...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙茜，
申请(专利权)人：踏石生物科技苏州有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32